楊 雪 邵華英 張瓊月 吳小紅

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院, 口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶市高校市級(jí)口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401147)

引言

緩釋微球是指藥物溶解或分散在高分子材料基質(zhì)中形成的微小球狀實(shí)體。關(guān)于微球制劑用于治療口腔常見(jiàn)疾病的研究在近10年得到飛速的發(fā)展[1-2]。近年來(lái)，用靜電紡絲的方法制備微球(即電噴微球)得到迅速發(fā)展，比傳統(tǒng)制備微球有明顯的優(yōu)勢(shì)：設(shè)備常規(guī)性，成本低，步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，產(chǎn)生的微球單分散性即粒徑一致性佳[3]。高分子載藥微球作為藥物控釋載體材料、吸附劑、表面修飾劑，在包裹親水性藥物時(shí)，需對(duì)疏水的高分子聚合物進(jìn)行親水性修飾，更利于細(xì)胞黏附[4-5]。

然而，制備單分散性良好、親水性佳的電噴微球，需要研究不同溶液體系下的電噴參數(shù)(如電壓、流速以及聚合物和藥物的種類(lèi)及濃度)對(duì)電噴模式的影響，穩(wěn)定的泰勒錐模式才能形成單分散性良好的微球[3]。聚己內(nèi)酯PCL是一種被FDA批準(zhǔn)的可生物降解的聚酯材料，其最大的優(yōu)點(diǎn)是降解時(shí)間長(zhǎng)，可作為長(zhǎng)期載藥的組織支架在組織工程中得到應(yīng)用[6]；同時(shí)，PCL對(duì)小分子藥物相溶性好，且相比PLGA等高分子材料所降解產(chǎn)生的酸性環(huán)境強(qiáng)度弱[7]。PCL制備的微球單分散性更強(qiáng)[8]，也是常用于制備電噴微球的聚合物。由于其極強(qiáng)的疏水性，在包裹親水性藥物時(shí)，為了減小突釋?zhuān)ǔＲ獙?duì)其進(jìn)行改性，對(duì)進(jìn)一步提高其包封率、延長(zhǎng)藥物緩釋時(shí)間很關(guān)鍵[9]。雙親類(lèi)物質(zhì)一般用于修飾疏水性的PCL，用作對(duì)親水性藥物的包裹[10]，雙親材料PEG-b-PCL可用于修飾PCL[11]，性能穩(wěn)定并具有較好的生物相容性[12]，但目前沒(méi)有關(guān)于PEG-b-PCL/PCL制備電噴微球的研究。筆者擬用PEG-b-PCL改善PCL親水性，并研究電噴微球隨不同PEG-b-PCL含量(以下簡(jiǎn)稱(chēng)雙親含量)的形態(tài)大小、粒徑分布以及親水程度的變化，同時(shí)討論能制備出單分散性良好的微球所需要的流速和電壓參數(shù)，旨在為進(jìn)一步制備載藥微球打下實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

靜電紡絲儀(北京永康樂(lè)業(yè)科技發(fā)展有限公司)，掃描電子顯微鏡(Jeol，Japan)，偏光顯微鏡(Nikon，Japan)，常溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，接觸角測(cè)量?jī)x(北京環(huán)球恒達(dá)科技有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8 CARS, Germany)，圖像分析軟件ImageJ-win64(NIH，USA)。

聚己內(nèi)酯(Mw=80 000, Sigma)，聚乙二醇-b-聚己內(nèi)酯(聚乙二醇Mw=2 000，聚己內(nèi)酯Mw=2 000，山東岱罡生物有限公司)，氯仿(分析純，山東化工)，超純水。

1.2 方法

1.2.1微球的制備

根據(jù)不同雙親含量比例(以PCL的重量為參照)進(jìn)行4% PCL(W/V)溶液配制(見(jiàn)表1)，配好的溶液在室溫下充分?jǐn)噭?dòng)2 h后加入裝有21號(hào)不銹鋼鈍性針頭的5 mL注射器(溫度23～25 ℃，濕度40%～45% RH)，針頭與高壓直流電源的正極相連，電壓設(shè)置變量值為8、10和12 kV，流速設(shè)置變量值為0.5、1.0、1.5 mL/h。在與針頭相距20 cm的接收滾筒上接負(fù)極，滾筒上覆蓋著鋁箔紙，作為微球的接收器，用于微球收集和電鏡觀察，而蓋玻片接收用來(lái)偏光顯微鏡觀察。電噴結(jié)束后，接收器置于通風(fēng)櫥中過(guò)夜，讓殘留的有機(jī)溶劑揮發(fā)，收集到的微球轉(zhuǎn)移至小玻璃瓶中儲(chǔ)存。

1.2.2微球的形態(tài)和大小

收集到微球的鋁箔紙剪成1 cm×1 cm，固定在樣品臺(tái)上，旋轉(zhuǎn)蒸鍍儀噴金，使用掃描電鏡(scanning electron microscope SEM)進(jìn)行觀察，電子加速度為20 kV；載玻片收集到的微球在偏振光顯微鏡下觀察，用imagej軟件測(cè)量微球直徑并計(jì)數(shù)(>100個(gè)/樣本)，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；微球直徑的單分散性即粒徑分布一致性，用變異系數(shù)CV(%)表示，值越低表明微球單分散性即粒徑分布一致性越佳。

CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值 (%)

(1)

表1不同雙親含量的電噴溶液

Tab.1Electrosprayingsolutionswithdifferentamphiphilic

content

含量/%01020電噴溶液S1S2S3

1.2.3接觸角測(cè)試

用鋁箔紙收集到的微球直接進(jìn)行接觸角儀器檢測(cè)，每組3個(gè)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)量3次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 22統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.4微球在水中的分散性

雙親含量為0%、10%、20%的微球分別稱(chēng)取4 mg，分別加入含有4 mL的EP管，渦旋混勻后形成1 mg/mL的微球混懸液，分別取微球混懸液滴于蓋玻片上，采用激光共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM)觀察微球在水中分散性。

2 結(jié)果

2.1 不同雙親含量微球的形態(tài)大小

2.1.1不同雙親含量微球的形態(tài)

如圖1所示，未加入雙親時(shí)，微球表面粗糙(見(jiàn)圖1(a)；加入10%～20%雙親后，微球表面相對(duì)光滑(見(jiàn)圖1(b)、(c)；繼續(xù)加入雙親30%后，光鏡圖(見(jiàn)圖1(d))可清晰地看見(jiàn)微球之間由纖維連接，沒(méi)有形成理想的微球形態(tài)，因此沒(méi)有進(jìn)行掃描電鏡的進(jìn)一步觀察。

圖1 不同雙親含量微球(電噴參數(shù)：流速1 mL/h，電壓10 kV)((a)～(c)左為光鏡圖，500×；中和右為掃描電鏡圖，分別為500×和2000×)的光鏡圖和掃描電鏡圖。(a)PCL；(b)PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親；(d)PCL/30%雙親(光鏡圖，500×)Fig.1 Optical microscopic and SEM pictures of microspheres with different amphiphilic content (electrospraying parameters: flow rate 1 mL/h, voltage 10 kV) ((a)-(c), left side are optical microscopic pictures, 500 times; middle and right side are SEM pictures, respectively 500 times and 2000 times). (a)PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c) PCL/20% amphiphilic content; (d)PCL/30% amphiphilic content (optical microscopic pictures, 500 times)

2.1.2不同雙親含量微球的大小

如圖2和表2所示，未加入雙親時(shí)，微球直徑為(18.08±5.52)μm；加入10%～20%雙親后，直徑由(6.25±0.94)μm降至(5.52±1.14)μm，微球粒徑分布一致性較好，直徑變異系數(shù)值為15%～21%；繼續(xù)加入雙親30%后，微球直徑分布較廣，變異系數(shù)值為38%，單分散性較差。

圖2 不同雙親含量微球的直徑分布直方圖。(a)PCL；(b) PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親；(d)PCL/30%雙親Fig.2 Distribution histographs about the diameters of microspheres with different amphiphilic content(n=100). (a) PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c)PCL/20% amphiphilic content; (d)PCL/30% amphiphilic content

表2不同雙親含量的微球直徑大小、形態(tài)及變異系數(shù)(n=100)

Tab.2Size,morphologyandsizedistributionofmicrosphereswithdifferentamphiphiliccontent(n=100)

微球直徑/μm形狀變異系數(shù)CV/%PCL18.08±5.52球形31PCL/10%雙親6.25±0.94球形15PCL/20%雙親5.52±1.14球形21PCL/30%雙親4.46±1.68球形+纖維38

2.2 不同流速和電壓微球的形態(tài)大小

2.2.1不同流速和電壓微球的形態(tài)

當(dāng)流速固定在0.5 mL/h、電壓為8和12 kV時(shí)，微球直徑由絲狀物質(zhì)連接，在電壓為12 kV時(shí)較明顯(見(jiàn)圖3(a)、(c))。但當(dāng)流速增至1.5 mL/h時(shí)，成球性相對(duì)較好，均未見(jiàn)絲狀纖維(見(jiàn)圖3(b)、(d))。而當(dāng)流速為1 mL/h、電壓為10 kV時(shí)，微球成球性較好(見(jiàn)圖1(b)、(e))。

2.2.2不同流速和電壓微球的大小

隨著流速增加,微球直徑也相應(yīng)增加，并且微球直徑與流速的平方根呈線性關(guān)系(見(jiàn)圖4(a))。未加入雙親材料時(shí)，微球直徑的變化較明顯(從14.4 μm到23.6 μm)，但加入10%和20%雙親后，變化范圍較窄(從4.75 μm到7.3 μm)，然而，加入雙親后，微球直徑的變異系數(shù)變低，單分散性提高。當(dāng)流速1 mL/h時(shí)，變異系數(shù)CV值最低為15%(見(jiàn)圖4(c))。

隨著電壓從8 kV增加到12 kV，微球直徑呈減小趨勢(shì)，加入雙親后的直徑變化不明顯(見(jiàn)圖4(b))， 電壓10 kV時(shí)變異系數(shù)CV值最低為15%，單分散性相對(duì)較佳(見(jiàn)圖4(d))。

2.3 不同雙親含量的微球親水性

未加入雙親時(shí)，PCL微球接觸角為126.2°±4.8°；加入10%雙親，接觸角約83.24°±5.65°；加入20%雙親，接觸角約29.9°±4.9°(見(jiàn)表3)。如圖5所示，加入雙親后，微球接觸角減小，3組差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 不同雙親含量的微球在水中的分散性

如圖6所示，將微球加入水后，不含雙親的微球并未均勻混合于水中，可見(jiàn)到微球于水面聚集，激光共聚焦顯微鏡下微球混懸液也呈現(xiàn)團(tuán)聚的現(xiàn)象；而加入雙親10%、20%后的微球能形成均勻的混懸液，激光共聚焦顯微鏡顯示微球在水中分散性較好。

表3 不同雙親含量的微球接觸角大小(n=3)

圖3 雙親含量為10%時(shí)不同電壓及流速參數(shù)下電噴微球的光鏡圖(500×)。(a)8 kV, 0.5 mL/h; (b)8 kV, 1.5 mL/h; (c)12 kV, 0.5 mL/h; (d)12 kV, 1.5 mL/h; (e)10 kV, 1 mL/hFig.3 Optical microscopic pictures of the electrosprayed microspheres with the amphiphilic content fixed at 10% under different parameters of voltage and flow rate (500×). (a)8 kV, 0.5 mL/h; (b)8 kV, 1.5 mL/h; (c) 12 kV, 0.5 mL/h; (d)12 kV, 1.5 mL/h; (e)10 kV, 1 mL/h

圖4 在電壓一定或者溶液流速一定的條件下，3種溶液電噴微球的平均直徑及粒徑分布。(a)電壓為10 kV時(shí)，微球直徑隨流速的變化；(b)流速為1 mL/h時(shí)，微球直徑隨電壓的變化；(c) 電壓為10 kV時(shí)，微球直徑的粒徑分布隨流速的變化；(d) 流速為1 mL/h時(shí)，微球直徑的粒徑分布隨電壓的變化Fig.4 Mean diameter and particle size distribution of electrosprayed microspheres of three solutions under certain voltage or flow rate. (a)When the voltage was 10 kV, the size of microspheres varied with flow rate; (b)When the flow rate was 1 mL/h, the size of microspheres varied with voltage. (c) When the voltage was 10 kV, the diameter distribution of the microspheres varied with the flow rate; (d)When the flow rate was 1 mL/h, the diameter distribution of the microspheres varied with voltage

圖5 不同雙親含量的微球接觸角。(a)PCL；(b)PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親Fig.5 Contact angle of microspheres with different amphiphilic content. (a)PCL; (b)PCL/10% amphiphilic content; (c) PCL/20% amphiphilic content

圖6 不同雙親含量的微球懸浮液(每行左為微球懸浮液的宏觀圖，右為微球懸浮液的激光共聚焦顯微鏡圖，400×)。(a)PCL；(b)PCL/10%雙親；(c)PCL/20%雙親Fig.6 Images of microsphere suspensions with different amphiphilic content (The left side of each row are macrographs of microsphere suspensions; The right side of each row are CLSM images of microsphere suspensions, magnification times, 400 times). (a)PCL; (b) PCL/10% amphiphilic content; (c)PCL/20% amphiphilic content

3 討論

3.1 微球表面形態(tài)的影響因素

電噴微球的形成主要由兩個(gè)機(jī)制控制:溶劑揮發(fā)的同時(shí)，聚合物高分子鏈纏繞擴(kuò)散，固化成微球。充分的溶劑揮發(fā)和足夠的聚合物擴(kuò)散，才能形成單分散性、球形的微球。與微球表面特性相關(guān)的有兩個(gè)指數(shù)Pe[3]和φRay[13]，有

(2)

(3)

式(3)中，φray指聚合物體積分?jǐn)?shù)，Q指流速，I指電流，γ指溶液表面張力，體現(xiàn)了電壓、流速對(duì)微球形態(tài)的影響。φray指聚合物高分子鏈纏繞的聚合物體積分?jǐn)?shù)：當(dāng)其足夠大時(shí)，液滴很難從穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)中逸出產(chǎn)生二級(jí)粒子；當(dāng)其較小時(shí)，二級(jí)粒子飛逸出被延伸成較細(xì)的纖維[15]。

因此，充分的溶劑揮發(fā)和聚合物擴(kuò)散對(duì)微球表面形態(tài)至關(guān)重要。氯仿沸點(diǎn)為61.2°，由圖(1(a))可見(jiàn)，微球表面輕度粗糙；由式(2)可見(jiàn)，當(dāng)加入雙親物質(zhì)10%～20%后，微球表面相對(duì)光滑，這可能是因?yàn)殡妵娙芤吼椥越档?，聚合物擴(kuò)散相對(duì)加快，在溶劑揮發(fā)的過(guò)程中，聚合物能得到相對(duì)較好的擴(kuò)散，形成的微球表面相對(duì)光滑(見(jiàn)圖1(b)，1(c))。而繼續(xù)加入30%雙親后，微球之間由較多纖維連接，這可能是因?yàn)槲⑶虮砻鎻埩p小明顯，φray值減小，容易產(chǎn)生纖維(見(jiàn)圖1(d))。

微球形成過(guò)程中，溶劑揮發(fā)徹底對(duì)形成單分散性良好的微球至關(guān)重要，影響溶劑揮發(fā)的因素除了溶劑種類(lèi)還有環(huán)境中濕度、溫度及接收距離等[3,16]。從圖(1(a)～(c))中可看到微球之間有明顯的粘連，這可能是由于有機(jī)溶劑不能徹底揮發(fā)所致[17-18]，微球在接收板上未完全固化，殘余的溶劑使得微球表面由于分子鏈纏繞而發(fā)生溶蝕作用，出現(xiàn)了微球的粘連。

當(dāng)微球流速固定在0.5 mL/h、電壓為8和12 kV時(shí)，微球直徑由絲狀纖維連接，在電壓為12 kV時(shí)較明顯(見(jiàn)圖3(a)、(c))，這是因?yàn)殡妷涸黾?，φray值減小，易生成纖維；當(dāng)電壓固定在12 kV、流速增至1.5 mL/h時(shí)，由于φray值增大，成球性相對(duì)較好，未見(jiàn)絲狀纖維(見(jiàn)圖3(b)、(d))。因此，高電壓時(shí)，適當(dāng)提高流速有利于微球的形成[13]。

3.2 微球直徑大小的影響因素

影響微球直徑大小的影響因素有很多，比如溶液導(dǎo)電性、流速等，直徑可表示[19]為

(4)

式中，Q指流速，ρ指溶液密度，γ指溶液導(dǎo)電性，σ指溶液表面張力。

該實(shí)驗(yàn)加入雙親PEG-b-PCL，微球粒徑變小(見(jiàn)圖2)。由式(4)所示，這可能是因?yàn)樗拥碾p親試劑含有氫鍵，溶液極性增加，使得溶液導(dǎo)電性增強(qiáng)，微球粒徑變小。同時(shí)，加入雙親10%～20%后，微球直徑分布的變異系數(shù)變低，這說(shuō)明電噴狀態(tài)穩(wěn)定，制備的微球單分散性較佳。

流速與微球直徑的平方根呈線性關(guān)系(見(jiàn)圖4(a))，意味著理論上微球直徑可以通過(guò)流速的變化來(lái)控制，這在未加入雙親材料時(shí)微球直徑的變化較明顯。但加入10%和20%雙親后，變化范圍較窄，這可能是因?yàn)榧尤腚p親后，溶液導(dǎo)電性增加，微球直徑減小，因流速而影響的直徑變化不明顯。加入雙親后，微球直徑的變異系數(shù)CV值減小，這是因?yàn)榇藭r(shí)溶液穩(wěn)定性提高，制備的微球單分散性增強(qiáng)。流速1 mL /h時(shí)， CV值較低，意味著電噴狀態(tài)較穩(wěn)定。

隨著電壓增加，微球直徑呈減小趨勢(shì)，加入雙親后的直徑變化不明顯(見(jiàn)圖4(b))，電壓10 kV時(shí)單分散性相對(duì)較佳(見(jiàn)圖4(d))。這可能是因?yàn)殡妷涸黾?，電?chǎng)中的液滴更容易庫(kù)倫裂變產(chǎn)生二級(jí)粒子，從而使微球直徑相應(yīng)變小；電壓10 kV時(shí)，CV值較低，意味著電噴狀態(tài)較穩(wěn)定。

3.3 微球表面的親水性

雙親材料PEG-b-PCL是由親水的聚乙二醇(PEG)和疏水的聚己內(nèi)酯(PCL)聚合形成的兩親性嵌段共聚物， 可用于改善PCL的親水性[9]，由圖5可見(jiàn)，雙親含量由0%增至10%和20%時(shí)，微球的親水性逐漸上升，微球接觸角由 126.2°±4.8°降至29.9°±4.9°(見(jiàn)表3)。材料表面親水性對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞行為有重要的作用，經(jīng)過(guò)研究表明，細(xì)胞在親水的表面黏附以及鋪展更佳[20]。

當(dāng)微球放入水中時(shí)，微球在水溶液中的聚集現(xiàn)象與微球混懸液中的氫鍵、范德華力有關(guān)[21]。在該實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)雙親含量為10%～20%的微球放入水中時(shí)，微球聚集的現(xiàn)象減輕。而雙親含量為0%的微球的聚集更明顯，宏觀上看微球更多的是貼于水面或管壁，而非均勻混于水中。激光共聚焦顯微鏡下可見(jiàn)：未加入雙親時(shí)，微球聚集較明顯(見(jiàn)圖6(a))；加入雙親后，微球分散象較好(見(jiàn)圖6(b)、(c))。這可能是因?yàn)楫?dāng)不含雙親時(shí)，微球表面疏水，在水中微球聚集成簇，疏水的微球于水液面或管壁聚集。因此，親水性佳的微球更容易形成均勻的混懸液，進(jìn)一步表明加入10%和20%雙親含量的微球親水性佳。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以PCL/PEG-b-PCL /氯仿為體系，研究了不同雙親含量(PEG-b-PCL)、電壓、流速對(duì)微球的形態(tài)大小及粒徑分布的影響，并研究了不同PEG-b-PCL含量對(duì)微球的親水程度影響。研究結(jié)果表明：電壓10 kV、流速為1 mL/h、雙親含量10%～20%時(shí)，能得到單分散性良好的微球；雙親含量20%時(shí)，微球表面接觸角為29.9°±4.9°，親水性較好。該研究為進(jìn)一步制備載藥微球打下基礎(chǔ)。