賈盼，張晶，楊洋，劉衛(wèi)敏，張建珍，趙小明

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飛蝗內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)糖蛋白基因的表達(dá)與功能分析

賈盼1,2，張晶1,2，楊洋1,2，劉衛(wèi)敏1，張建珍1，趙小明1

（1山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所，太原 030006；2山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006）

【目的】分析飛蝗（）內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)糖蛋白（endocuticle structural glycoprotein）基因的序列特征和表達(dá)特性，利用RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)結(jié)合Hematoxylin and eosin（H&E）染色方法以及透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）技術(shù)探究其生物學(xué)功能，探討其對(duì)飛蝗內(nèi)表皮發(fā)育的影響。【方法】基于課題組飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的cDNA編碼序列，并克隆驗(yàn)證。利用ExPASy工具翻譯LmAbd-2氨基酸序列，然后利用SignaIP4.1Server和SMART軟件分別對(duì)其信號(hào)肽和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用NetOGlyc4.0 Server對(duì)其糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，使用GENEDOC軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，并利用MEGA 6.0軟件中neighbor-joining（NJ）方法與其他昆蟲同源序列進(jìn)行聚類分析。采用熒光定量PCR（reverse- transcription quantitative PCR，RT-qPCR）分析在飛蝗5齡第2天不同組織以及4齡（N4D1—N4D6）、5齡（N5D1—N5D8）和成蟲（AD1—AD4）表皮不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式。采用RNAi技術(shù)結(jié)合H&E染色方法以及TEM技術(shù)觀察干擾后對(duì)飛蝗生長(zhǎng)發(fā)育和表皮結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】序列分析結(jié)果顯示，飛蝗cDNA編碼序列長(zhǎng)為683 bp，開放閱讀框?yàn)?59 bp，編碼152個(gè)氨基酸；功能域分析發(fā)現(xiàn)LmAbd-2含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin binding domain 4，ChtBD4），屬于CPR家族RR-1亞類；序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)其在物種間具有較高的保守性，其中與沙漠蝗（）SgAbd-2序列相似度為92.5%，且在N末端含有一個(gè)保守基序PTPPPIP，其中第2位蘇氨酸為糖基化位點(diǎn)；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示LmAbd-2與SgAbd-2聚為一支，親緣關(guān)系最近；RT-qPCR分析結(jié)果顯示在體壁中高表達(dá)，且在蛻皮后（內(nèi)表皮形成時(shí)期）高表達(dá)；沉默后飛蝗沒(méi)有肉眼可見(jiàn)的表型，但H&E染色結(jié)果顯示與對(duì)照組相比飛蝗表皮層變薄，進(jìn)一步超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)減少?！窘Y(jié)論】LmAbd-2是一種內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)糖蛋白，屬于CPR家族RR-1亞類，其編碼基因主要在體壁中高表達(dá)，而且在飛蝗4齡、5齡和成蟲內(nèi)表皮形成時(shí)期呈周期性表達(dá)；RNAi試驗(yàn)表明，在飛蝗蛻皮過(guò)程中參與內(nèi)表皮的形成。

飛蝗；內(nèi)表皮；糖蛋白；；RNA干擾

0 引言

【研究意義】昆蟲體壁主要由上表皮（epicuticle）、外表皮（exocuticle）、內(nèi)表皮（endocuticle）和真皮細(xì)胞層（epidermal cell）組成[1]，其在維持蟲體外部形態(tài)、防止體內(nèi)水分蒸發(fā)、阻止病菌入侵等方面具有重要作用[2]。昆蟲在蛻皮過(guò)程中首先合成上表皮和外表皮（在蛻皮前合成），然后在蛻皮后逐漸合成內(nèi)表皮[3]。表皮蛋白（cuticle protein，CP）是昆蟲體壁的重要組成成分，其編碼基因在昆蟲基因組總基因中所占比例超過(guò)1%[4]，在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、表皮物理特性以及蟲體形態(tài)構(gòu)成中具有重要作用[1]。飛蝗（）是一種漸變態(tài)世界性農(nóng)業(yè)害蟲，對(duì)RNA干擾（RNA interference，RNAi）具有敏感性，是基于RNAi研究基因功能的理想模型。因此，以飛蝗蛻皮后表皮蛋白基因?yàn)檠芯繉?duì)象，探討其分子特性、表達(dá)模式及生物學(xué)功能，可為蛻皮后表皮蛋白基因在漸變態(tài)昆蟲蛻皮過(guò)程中參與內(nèi)表皮形成的作用機(jī)制研究提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，隨著黑腹果蠅（）、赤擬谷盜（）、家蠶（）、岡比亞按蚊（）、褐飛虱（）、煙草天蛾（）等昆蟲基因組測(cè)序的完成，越來(lái)越多的CPs或CP-like蛋白被鑒定[5-10]。根據(jù)所含基序不同，這些CPs被分為不同家族，如數(shù)目最多的CPR家族（包括RR-1、RR-2和RR-3 3個(gè)亞類）、CPAPs家族、Tweedle家族、CPF/CPFL家族、CPG家族以及CPH家族等。在雙翅目黑腹果蠅、鞘翅目赤擬谷盜、鱗翅目家蠶、半翅目褐飛虱等昆蟲中CPR家族表皮蛋白在表皮分化、鞘翅片層結(jié)構(gòu)形成、翅原基發(fā)育以及蟲體生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要作用[10-17]。同樣，CPAPs家族表皮蛋白在昆蟲體形和生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用[18-20]。目前，對(duì)其他家族表皮蛋白基因的功能研究也取得了重要進(jìn)展，如甜菜夜蛾（）CPG家族蛋白基因（、和）的缺失導(dǎo)致表皮黑化變硬和蛻皮致死[21]；LU等干擾褐飛虱未分組表皮蛋白（不屬于任何已分類家族）基因（主要表達(dá)于蛻皮后時(shí)期）可導(dǎo)致蟲體發(fā)育異?；蛑滤溃⑶矣绊憙?nèi)表皮的形 成[17]；家蠶蛻皮后高表達(dá)表皮蛋白基因在維持蟲體形態(tài)和內(nèi)表皮的形成中具有重要作用[16]。在蝗蟲中，20世紀(jì)90年代，丹麥科學(xué)家Andersen[22]通過(guò)雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜分析方法從沙漠蝗（）成蟲腹部表皮中鑒定出了8個(gè)內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)蛋白（endocuticle structural protein），分別命名為SgAbd-1、SgAbd-2、SgAbd-3、SgAbd-4、SgAbd-5、SgAbd-6、SgAbd-8、SgAbd-9。在飛蝗中，根據(jù)這8個(gè)內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列筆者課題組前期基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了相應(yīng)的同源蛋白序列[23]，分別命名為L(zhǎng)mAbd-1、LmAbd-2、LmAbd-3、LmAbd-4、LmAbd-5、LmAbd-6、LmAbd-8、LmAbd-9，它們均屬于CPR家族RR-1亞類，并且研究發(fā)現(xiàn)主要表達(dá)于外胚層形成的組織中，可能參與飛蝗內(nèi)表皮的形成[24]。然而，這些表皮蛋白基因在飛蝗蛻皮過(guò)程中的具體功能尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，盡管表皮蛋白基因在模式昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的功能研究取得了較大進(jìn)展，但對(duì)于漸變態(tài)昆蟲飛蝗表皮蛋白的研究主要集中于表皮蛋白的鑒定和分類，對(duì)其編碼基因的表達(dá)模式及功能尚缺乏系統(tǒng)研究，尤其是蛻皮后表皮蛋白基因在內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)形成中具有怎樣的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以重要農(nóng)業(yè)害蟲——飛蝗為研究對(duì)象，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的內(nèi)表皮蛋白基因，研究其分子特性、組織和時(shí)期表達(dá)特性，并基于RNAi方法結(jié)合H&E染色以及透射電鏡技術(shù)分析其生物學(xué)功能，探討其在飛蝗蛻皮過(guò)程中對(duì)內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)形成的影響，為闡明蛻皮后表皮蛋白在內(nèi)表皮形成中的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2017—2018年在山西大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所完成。

1.1 供試?yán)ハx與試劑

將飛蝗蟲卵（購(gòu)自河北滄州蝗蟲養(yǎng)殖基地）包裹于已扎孔透明塑料袋中，置于昆蟲恒溫培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行孵化，孵化后轉(zhuǎn)移至紗籠（30 cm×30 cm×30 cm）內(nèi)，控制昆蟲培養(yǎng)室內(nèi)環(huán)境：溫度為（30±2）℃，相對(duì)濕度為（40±10）%，光周期為14 h﹕10 h（L﹕D），以新鮮小麥苗和麥麩飼喂。

試劑：動(dòng)物組織RNA提取試劑（RNAisoTMPlus）、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑（Reverse Transcriptase M-MLV，5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer，Recombinant RNase Inhibitor，dNTP Mixture）、實(shí)時(shí)熒光定量試劑（TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ）購(gòu)自TaKaRa公司；dsRNA合成試劑盒（T7 RiboMAXTMExpress RNAi System）購(gòu)自Promega公司；RNase Free H2O等其他試劑購(gòu)自生工生物（上海）有限公司。

1.2 LmAbd-2 cDNA序列分析

根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組的cDNA編碼序列，克隆測(cè)序后，利用NCBI中的Open Reading Frame Finder（ORF Finder）（http://cms.ncbi.nlm.nih.gov/orf finder/）工具找到的全長(zhǎng)ORF序列，利用ExPASy網(wǎng)站在線翻譯工具翻譯成氨基酸序列（https://web. expasy.org/translate/），并預(yù)測(cè)蛋白分子量大小及等電點(diǎn)（pI）（https://web.expasy.org/compute_pi/）；利用SignaIP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）預(yù)測(cè)其信號(hào)肽，利用SMART（http://smart. embl-heidelberg.de/）分析其結(jié)構(gòu)域，利用GENEDOC軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，利用NetOGlyc4.0 Server預(yù)測(cè)其糖基化位點(diǎn)（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/），利用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析其保守基序。

1.3 序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI網(wǎng)站下載不同昆蟲物種Abd-2氨基酸序列，利用MEGA 6.0軟件中neighbor-joining（NJ）方法將LmAbd-2氨基酸序列與沙漠蝗、德國(guó)小蠊（）、赤擬谷盜、斜紋夜蛾（）、褐飛虱等不同目物種的同源氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，獨(dú)立分析1 000次，數(shù)值代表bootstrap估算值。不同目物種Abd-2序列和飛蝗LmAbd-2序列的GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1。

1.4 LmAbd-2組織特異性和時(shí)期表達(dá)分析

組織特異性表達(dá)分析：解剖發(fā)育整齊的5齡第2天（N5D2）飛蝗若蟲的體壁（integument，IN）、前腸（foregut，F(xiàn)G）、中腸（midgut，MG）、后腸（hindgut，HG）、胃盲囊（gastric caeca，GC）、馬氏管（Malpighian tubules，MT）、脂肪體（fat body，F(xiàn)B）和翅芽（wing pad，WP）8個(gè)不同組織，設(shè)置4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3頭蟲體。時(shí)期表達(dá)分析：選取并解剖4齡第1—6天飛蝗若蟲（N4D1—N4D6）、5齡第1—8天飛蝗若蟲（N5D1—N5D8）和成蟲第1—4天（AD1—AD4）第2腹節(jié)處體壁組織，設(shè)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每3頭蟲體組織為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，組織樣品凍存于液氮中。利用動(dòng)物組織RNA提取試劑RNAisoTMPlus（TaKaRa公司）提取上述不同組織和不同發(fā)育時(shí)期體壁組織的總RNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，利用Nanodrop 2000對(duì)總RNA進(jìn)行定量。以1 μg總RNA為模板，使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑（TaKaRa公司）合成cDNA模板。采用熒光定量PCR方法（reverse-transcription quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)在5齡第2天飛蝗不同組織部位及不同發(fā)育時(shí)期體壁中的表達(dá)情況。RT-qPCR反應(yīng)體系和程序參考文獻(xiàn)[25]。（KX276642）作為內(nèi)參基因，引物見(jiàn)表2（由上海生工生物公司合成）。

表1 本研究中用于構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的物種和Abd-2的GenBank登錄號(hào)

表2 本研究中所用引物

1.5 基于RNAi的LmAbd-2生物學(xué)功能分析

為了探討在飛蝗表皮形成中的作用，利用T7 RiboMAXTMExpress試劑盒（Promega公司）體外合成該基因雙鏈RNA（dsRNA），以綠色熒光蛋白基因（）為對(duì)照。利用微量注射器向4齡第3天（N4D3）若蟲第2—3腹節(jié)處注射10 μg ds和ds，正常飼養(yǎng)；若飛蝗正常蛻皮后，再向5齡第4天（N5D4）若蟲注射10 μg的ds和ds，24 h后利用1.4中RT-qPCR方法檢測(cè)沉默效率，其余若蟲正常飼養(yǎng)、觀察表型。

1.6 表皮顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察

為了觀察干擾后對(duì)飛蝗表皮結(jié)構(gòu)的影響，取5齡蛻皮后72 h的對(duì)照組和處理組腹部表皮樣品（第3腹節(jié)）于3%戊二醛溶液中4℃固定過(guò)夜。固定的樣品進(jìn)行石蠟包埋、切片，然后用蘇木精和伊紅（hematoxylin-eosin staining，H&E）染色[26-27]、封片后利用顯微鏡（Olympus BX51，Japan）觀察表皮結(jié)構(gòu)。

為進(jìn)一步從超微結(jié)構(gòu)分析對(duì)飛蝗內(nèi)表皮形成的影響，用透射電鏡技術(shù)觀察表皮結(jié)構(gòu)變化。用于透射電鏡觀察的腹部表皮樣品固定、切片制備和染色等方法參考文獻(xiàn)[25]。

1.7 數(shù)據(jù)分析

基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[28]進(jìn)行分析，采用Student t-test方法進(jìn)行差異表達(dá)分析，*表示在＜0.05水平差異顯著，**表示在＜0.01水平差異顯著，***表示在＜0.001水平差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 LmAbd-2的序列結(jié)構(gòu)特征

根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得cDNA編碼序列并進(jìn)行了克隆和測(cè)序驗(yàn)證，其編碼序列長(zhǎng)為689 bp，其中ORF為459 bp, 編碼152個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為16.98 kD，等電點(diǎn)為5.28，為偏酸性表皮蛋白。序列分析發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)信號(hào)肽和1個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin binding domain 4，ChtBD4）（圖1-A），并且具有RR-1保守基序，屬于CPR家族RR-1亞類（圖1-B）。

A：LmAbd-2的序列分析Sequence analysis of LmAbd-2；下劃線為信號(hào)肽The underline: signal peptide，方框內(nèi)為幾丁質(zhì)結(jié)合域The box: chitin binding domain 4, ChtBD4。B：Weblogo分析LmAbd-2保守基序Analysis of conserved motifs by Weblogo (http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)

2.2 Abd-2序列比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)LmAbd-2與沙漠蝗、褐飛虱、赤擬谷盜和棉鈴蟲（）等Abd-2序列具有較高相似性，其中與沙漠蝗SgAbd-2的氨基酸序列相似度高達(dá)92.5%（信號(hào)肽除外），幾丁質(zhì)結(jié)合域序列完全一致（圖2-A）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Abd-2 N末端存在一個(gè)保守基序PTPPPIP，且第2位蘇氨酸（T）是O-連接糖基化位點(diǎn)（O-GalNAc）（圖2-A），與SgAbd-2類似，是一個(gè)糖基化蛋白[22]。將獲得的飛蝗Abd-2氨基酸序列與其他昆蟲的Abd-2氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示LmAbd-2與沙漠蝗SgAbd-2聚為一支，具有較近的親緣關(guān)系（圖2-B）。

A：LmAbd-2與其他昆蟲表皮蛋白Abd-2多序列比對(duì) Multiple sequence alignments of LmAbd-2 and Abd-2 from different insect species；B：LmAbd-2與其他昆蟲Abd-2的系統(tǒng)聚類分析 the phylogenetic analysis of LmAbd-2 and Abd-2 from different insect species

2.3 LmAbd-2組織特異性和發(fā)育時(shí)期表達(dá)

RT-qPCR分析結(jié)果顯示在體壁中高表達(dá)，在其他組織中低表達(dá)或不表達(dá)（圖3-A）。發(fā)育時(shí)期結(jié)果顯示，在4齡（N4D1—N4D2）、5齡（N5D1—N5D3）和成蟲早期（AD1—AD3）呈周期性高表達(dá)，其他時(shí)期表達(dá)較低（圖3-B），這種表達(dá)模式與內(nèi)表皮形成時(shí)間一致，推測(cè)其可能參與飛蝗內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。

2.4 LmAbd-2的生物學(xué)功能

為了探討在飛蝗表皮形成中的作用，體外合成dsRNA并向4齡第3天飛蝗若蟲注射10 μg的ds和ds，正常飼養(yǎng)至蛻皮。結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理組和對(duì)照組均能正常蛻皮至5齡且無(wú)肉眼可見(jiàn)表型（被顯著沉默）。向該5齡期若蟲再次分別注射10 μg的ds和ds，結(jié)果顯示再次注射ds的若蟲和對(duì)照組仍均能正常蛻皮，盡管在蛻至成蟲72 h后表達(dá)量顯著降低（處理組中表達(dá)量顯著降低了97.8%）（圖4-A），但未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的異常表型。H&E染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，注射ds的處理組表皮層結(jié)構(gòu)變薄（減少約40%）（圖4-B）；透射電鏡結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組內(nèi)表皮片層數(shù)減少（約減少6層），使得整個(gè)表皮層結(jié)構(gòu)變薄（圖4-C），表明參與飛蝗內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。

A：LmAbd-2在5齡飛蝗不同組織中的表達(dá) The relative expression of LmAbd-2 in different tissues of 5th instar nymphs。IN：體壁 Integument；WP：翅芽 Wing pads；GC：胃盲囊Gastric caeca；FG：前腸 Foregut；MG：中腸 Midgut；HG：后腸 Hindgut；MT：馬氏管Malpighian tubules；FB：脂肪體 Fat body；B：LmAbd-2在飛蝗4齡（第1—6天）、5齡（第1—8天）和成蟲早期（第1—4天）不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)The relative expression of LmAbd-2 in different days of 4th instar nymphs (Day 1 to day 6), 5th instar nymphs (Day 1 to day 8), and early stages of adult (Day 1 to day 4)

3 討論

體壁是覆蓋在昆蟲身體表面的保護(hù)性和支撐性的結(jié)構(gòu)，其主要成分是表皮蛋白和幾丁質(zhì)，其成分的缺失或含量變化都可能影響體壁結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)而影響昆蟲的正常生長(zhǎng)發(fā)育。本文根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得一個(gè)蛻皮后表皮蛋白基因，其編碼蛋白序列特征分析發(fā)現(xiàn)含有一個(gè)RR-1基序（GxFxYxxPDGxxxxVxYxADENGYQPxGAHLP），與沙漠蝗SgAbd-2的氨基酸序列具有92.5%的相似度（信號(hào)肽除外），均屬于CPR家族RR-1亞類[4]。隨著基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展，除直翅目飛蝗和沙漠蝗外，有很多昆蟲物種的Abd-2或Abd-2 like被鑒定，如鱗翅目棉鈴蟲、半翅目褐飛虱、蜚蠊目德國(guó)小蠊、以及鞘翅目赤擬谷盜等。然而，這些基因僅僅是序列在NCBI中報(bào)道，尚未有功能研究報(bào)道。

有研究報(bào)道，RR-1亞類的表皮蛋白主要存在于柔軟表皮中，如雙翅目和鱗翅目幼蟲表皮、蝗蟲節(jié)間膜和內(nèi)表皮中[6,22]。昆蟲在蛻皮過(guò)程中表皮依次形成片層結(jié)構(gòu)，其中蛻皮前主要形成上表皮和外表皮，而內(nèi)表皮主要在蛻皮后開始形成和沉積，蛻皮后約72 h完全形成[29]。組織和時(shí)期表達(dá)結(jié)果顯示主要在飛蝗體壁中高表達(dá)，而且發(fā)現(xiàn)其在所試飛蝗各個(gè)齡期內(nèi)表皮形成時(shí)期呈周期性高表達(dá)（圖3），暗示其可能參與飛蝗內(nèi)表皮的合成和沉積。利用飛蝗對(duì)RNAi的敏感性，本文首先在4齡若蟲期沉默的表達(dá)，隨后在5齡若蟲期連續(xù)干擾的表達(dá)，雖然均未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的異常表型，但從顯微和超微結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)減少導(dǎo)致表皮層結(jié)構(gòu)變?。▓D4），表明參與飛蝗內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。該基因與家蠶假設(shè)表皮蛋白基因、褐飛虱未分組表皮蛋白基因以及飛蝗其他家族表皮蛋白基因功能類似[16-17,27]，均在昆蟲內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)形成具有重要作用。

根據(jù)表皮片層結(jié)構(gòu)形成時(shí)期的不同，Andersen利用MALDI-MS分析方法從沙漠蝗蛻皮后表皮組織中鑒定出8種RR-1亞類蛻皮后表皮蛋白[22]，課題組前期從飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到與這8種沙漠蝗蛻皮后表皮蛋白同源序列[23]，其中研究發(fā)現(xiàn)LmAbd-5參與飛蝗內(nèi)表皮的形成[24]。然而，沉默的表達(dá)后，結(jié)果與LmAbd-2類似均未引起飛蝗肉眼可見(jiàn)的異常表型。Pan等[10]利用RNAi方法對(duì)褐飛虱表皮蛋白基因功能研究發(fā)現(xiàn)僅部分基因產(chǎn)生致死表型，推測(cè)表皮蛋白可能與其他表皮蛋白相互作用而存在互補(bǔ)效應(yīng)。在飛蝗中，這8種蛻皮后表皮蛋白在蛻皮過(guò)程中可能存在協(xié)同或互補(bǔ)作用，但尚有待進(jìn)一步的研究。

A：若蟲期連續(xù)注射dsLmAbd-2蛻皮至成蟲72 h后LmAbd-2的相對(duì)表達(dá)量 The relative expression of LmAbd-2 determined by RT-qPCR after injected with dsLmAbd-2 72 h。B：注射dsRNA后，蛻皮至成蟲72 h的表皮顯微結(jié)構(gòu) After injection of dsRNA, microstructure and magnification of cuticle by H&E staining；紅色為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞外基質(zhì)，藍(lán)色為細(xì)胞核cytoplasm and extracellular matrix are stained red with eosin, nuclei are stained dark blue with hematoxylin (Scale bars, 20 μm)，Cut：表皮Cuticle；Ec：表皮細(xì)胞Epidermal cell。C：注射dsRNA后，蛻皮至成蟲72 h的表皮超微結(jié)構(gòu)觀察Ultrastructure observation of adult cuticle at 72 h after injected with dsRNA。Epi：上表皮Epicuticle；Exo：外表皮Exocuticle；Endo：內(nèi)表皮Endocuticle

4 結(jié)論

飛蝗是一個(gè)內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)糖蛋白基因，其編碼的蛋白含有一個(gè)信號(hào)肽和一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域ChtBD4，屬于CPR家族RR-1亞類；主要在飛蝗體壁組織中高表達(dá)，而且在所試飛蝗各齡期內(nèi)表皮形成時(shí)期呈周期性高表達(dá)；連續(xù)在若蟲期干擾后未出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的表型，但內(nèi)表皮片層結(jié)構(gòu)減少，表明其參與飛蝗內(nèi)表皮結(jié)構(gòu)的形成。

[1] Moussian B, Seifarth C, Müller U, Berger J, SchwarzH. Cuticle differentiation duringembryogenesis., 2006, 35(3): 137-152.

[2] Vincent J F, Wegst U G. Design and mechanical properties of insect cuticle.,2004, 33(3): 187-199.

[3] Noh M Y, Muthukrishnan S, Kramer K J, Arakane Y. Development and ultrastructure of the rigid dorsal and flexible ventral cuticles of the elytron of the red flour beetle,.,2017, 91: 21-33.

[4] Willis J H. Structural cuticular proteins from arthropods: annotation, nomenclature, and sequence characteristics in the genomics era.,2010, 40(3): 189-204.

[5] Karouzou M V, Spyropoulos Y, Iconomidou V A, Cornman R S, Hamodrakas S J, Willis J H.cuticular proteins with the R&R Consensus: annotation and classification with a new tool for discriminating RR-1 and RR-2 sequences.,2007, 37(8): 754-760.

[6] Cornman R S, Togawa T, Dunn W A, He N, Emmons A C, Willis J H. Annotation and analysis of a large cuticular protein family with the R&R Consensus in.,2008, 9: 22.

[7] Futahashi R, Okamoto S, Kawasaki H, Zhong Y S, Iwanaga M, Mita K, Fujiwara H. Genome-wide identification of cuticular protein genes in the silkworm,.,2008, 38(12): 1138-1146.

[8] Ioannidou Z S, Theodoropoulou M C, Papandreou N C, Willis J H, Hamodrakas S J. CutProtFam-Pred: detection and classification of putative structural cuticular proteins from sequence alone, based on profile hidden Markov models.,2014, 52: 51-59.

[9] Dittmer N T, Tetreau G, Cao X, Jiang H, Wang P, Kanost M R. Annotation and expression analysis of cuticular proteins from the tobacco hornworm,.,2015, 62: 100-113.

[10] Pan P L, Ye Y X, Lou Y H, Lu J B, Cheng C, Shen Y, Moussian B, Zhang C X. A comprehensive omics analysis and functional survey of cuticular proteins in the brown planthopper.,2018, 115(20): 5175-5180.

[11] Guan X, Middlebrooks B W, Alexander S, WassermanS A. Mutation of TweedleD, a member of an unconventional cuticle protein family, alters body shape in.,2006, 103(45): 16794-16799.

[12] Arakane Y, Lomakin J, Gehrke S H, Hiromasa Y, Tomich J M, Muthukrishnan S, Beeman R W, Kramer K J, Kanost M R. Formation of rigid, non-flight forewings (Elytra) of a beetle requires two major cuticular proteins.,2012, 8(4): e1002682.

[13] Qiao L, Xiong G, Wang R X, He S Z, Chen J, Tong X L, Hu H, Li C L, Gai T T, Xin Y Q, LIU X F, CHEN B, XIANG Z H, LU C, DAI F YMutation of a cuticular protein,, alters larval body shape and adaptability in silkworm,.,2014, 196(4): 1103-1115.

[14] Mun S, Young Noh M, Dittmer N T, Muthukrishnan S, Kramer K J, Kanost M R, Arakane Y. Cuticular protein with a low complexity sequence becomes cross-linked during insect cuticle sclerotization and is required for the adult molt.,2015, 5: 10484.

[15] Noh M Y, Muthukrishnan S, Kramer K J, Arakane Y.RR-1 cuticular protein TcCPR4 is required for formation of pore canals in rigid cuticle.,2015, 11(2): e1004963.

[16] Xiong G, Tong X L, Gai T T, Li C, Qiao L, Monteiro A, Hu H, Han M J, Ding X, Wu S Y, XIANG Z H, LU C, DAI F YBody shape and coloration of silkworm larvae are influenced by a novel cuticular protein.,2017, 207(3): 1053-1066.

[17] Lu J B, Luo X M, Zhang X Y, Pan P L, Zhang C X. An ungrouped cuticular protein is essential for normal endocuticle formation in the brown planthopper.,2018, 100: 1-9.

[18] Petkau G, Wingen C, Jussen L C, Radtke T, Behr M. Obstructor-A is required for epithelial extracellular matrix dynamics, exoskeleton function, and tubulogenesis.,2012, 287(25): 21396-21405.

[19] 王燕, 李大琪, 劉曉健, 李濤, 馬恩波, 范仁俊, 張建珍. 飛蝗表皮蛋白家族基因的分子特性及基于RNAi的功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2015, 48(1): 73-82.

WANG Y, LI D Q, LIU X J, LI T, MA E B, FAN R J, ZHANG J Z. Molecular characterization and RNAi-based functional analysis offamily genes in., 2015, 48(1): 73-82. (in Chinese)

[20] Tajiri R, Ogawa N, Fujiwara H, Kojima T. Mechanical control of whole body shape by a single cuticular protein obstructor-E in.,2017, 13(1): e1006548.

[21] Jan S, Liu S, Hafeez M, Zhang X, Dawar F U, Guo J, Gao C, Wang M. Isolation and functional identification of three cuticle protein genes during metamorphosis of the beet armyworm,.,2017, 7: 16061.

[22] Andersen S O. Amino acid sequence studies on endocuticular proteins from the desert locust,.,1998, 28(5/6): 421-434.

[23] Zhao X M, Gou X, Qin Z Y, Li D Q, Wang Y, Ma E B, Li S, Zhang J Z. Identification and expression of cuticular protein genes based ontranscriptome.,2017, 7: 45462.

[24] 趙小明, 賈盼, 勾昕, 劉衛(wèi)敏, 馬恩波, 張建珍. 飛蝗內(nèi)表皮蛋白基因的表達(dá)與功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2017, 50(10): 1817-1826.

ZHAO X M, JIA P, GOU X, LIU W M, MA E B, ZHANG J Z. Expression and functional analysis of endocuticle structural glycoprotein genein., 2017, 50(10): 1817-1826. (in Chinese)

[25] Zhao X M, Qin Z Y, Liu W M, Liu X J, Moussian B, Ma E B, Li S, Zhang J Z. Nuclear receptor HR3 controls locust molt by regulating chitin synthesis and degradation genes of.,2018, 92: 1-11.

[26] Song T Q, Yang M L, Wang Y L, Liu Q, Wang H M, Zhang J, Li T. Cuticular protein LmTwdl1 is involved in molt development of the migratory locust.,2016, 23(4): 520-530.

[27] 楊亞亭, 趙小明, 秦忠玉, 劉衛(wèi)敏, 馬恩波, 張建珍. 飛蝗表皮蛋白基因的分子特性及功能分析. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2018, 51(7): 1303-1314.

YANG Y T, ZHAO X M, QIN Z Y, LIU W M, MA E B, ZHANG J Z. Molecular characteristics and function analysis of cuticle protein gene., 2018, 51(7): 1303-1314. (in Chinese)

[28] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2ΔΔCtmethod.,2001, 25(4): 402-408.

[29] Charles J P. The regulation of expression of insect cuticle protein genes.,2010, 40(3): 205-213.

（責(zé)任編輯 岳梅）

Expression and Function Analysis of Endocuticle structural Glycoprotein Gene

Jia Pan1,2, Zhang Jing1,2, Yang Yang1,2, Liu WeiMin1, Zhang JianZhen1, Zhao XiaoMing1

(1Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006)

【Objective】The objective of this study is to analyze the sequence and expression characteristics of endocuticle structural glycoprotein genethat identified fromtranscriptome, explore its function by Hematoxylin and eosin (H&E) staining and transmission electron microscopy (TEM) based on RNAi with ds, and to discuss the effect on the formation of endocuticle duringmolting.【Method】The cDNA sequence ofwas obtained according to the transcriptome database of, and was cloned by reverse-transcription PCR (RT-PCR) and sequenced. The amino acid sequence of LmAbd-2 was translated by ExPASy tool, and its signal peptide and structural domain were analyzed by using SignaIP4.1Server and SMART software, respectively. Meanwhile, the O-linked glycosylation sites were predicted by using NetOGlyc4.0 Server. The homologous sequences of Abd-2 from locust and other insect species were aligned by GENEDOC software and evolutionary tree was constructed by using the MEGA 6.0 software with the neighbor-joining (NJ) method. Expression profiles ofdifferent tissues at day 2 of 5th instar nymphs and developmental days of 4th instar nymphs (N4D1-N4D6), 5th instar nymphs (N5D1-N5D8), and the early stage of adults (AD1-AD4) were assayed by using reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). The biological function ofwas analyzed by combination of RNAi and H&E staining and TEM methods. 【Result】The results ofsequence analysisshowed that the length of thecDNA is 683 bp and full length of its ORF is 459 bp, encoding 152 amino acids. The functional domainanalysis showed that the protein encoded bycontains one signal peptide and one chitin binding domain (ChtBD4), which belongs to RR-1 subclass of the CPR family. Sequence alignment analysis showed that it is highly conserved among species, and the similarity with SgAbd-2 is 92.5%, and it contains conserved motif (PTPPPIP) in N-terminal and has a potential O-linked glycosylation site (T116) at which glycosylation modification may occur. Phylogenetic tree analysis showed that LmAbd-2 has a close genetic relationship with SgAbd-2 of. The results of RT-qPCR revealed thatwas highly expressed in the integument, but lower or no expression in other tested tissues, and showed periodic expression during molting. After injection of dson day 3 of 4th instar nymphs and day 4 of 5th instar nymphs, the insects could normally molt to adults and showed no macroscopic phenotype; however, the cuticle of the adults was thinner, and there were significantly fewer endocuticular lamellae than those in the control.【Conclusion】An endocuticle structural glycoprotein genewas obtained according to thetranscriptome database. The protein encoded bybelongs to RR-1 subclass of CPR family.was mainly expressed in integument among all the tested tissues and showed periodic expression at the early stage of 4th instar nymphs, 5th instar nymphs and adults. The results of RNAi suggested thatwas involved in the formation of endocuticle duringmolting.

; endocuticle; glycoprotein;; RNAi

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.04.007

2018-09-29；

2018-11-15

國(guó)家自然科學(xué)基金（31702067，31640075）、山西省青年科學(xué)基金（201601D021102）

賈盼，Tel：0351-7018871；E-mail：120768708@qq.com。 通信作者趙小明，Tel：0351-7018871；E-mail：zxming@sxu.edu.cn