陳秋宇 趙 威 張 馨 張莉莉 王 彬 晉 弘 王邦茂

天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科(300052)

背景：賁門失弛緩癥是一種病因尚不明確的食管動力障礙性疾病，表現(xiàn)為食管壁內(nèi)神經(jīng)叢不可逆性損傷導(dǎo)致下食管括約肌(LES)松弛功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)賁門失弛緩癥患者的食管下端平滑肌呈現(xiàn)重塑現(xiàn)象。目的：探討硫化氫治療對賁門失弛緩癥動物模型食管重塑標(biāo)志物表達(dá)的影響。方法：予BALB/c小鼠LES注射芐基二甲基十四烷基氯化銨(BAC)建立賁門失弛緩癥動物模型，并予腹腔注射外源性硫化氫供體硫氫化鈉。比較接受與未接受硫化氫治療的模型小鼠以及對照組小鼠的食管測壓結(jié)果，以免疫組化染色檢測食管重塑標(biāo)志物肌動蛋白、彈性蛋白表達(dá)。結(jié)果：成功建立賁門失弛緩癥小鼠模型。與對照組相比，模型組和治療組小鼠LES壓力增高，肌動蛋白、彈性蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，治療組上述指標(biāo)的變化均輕于模型組(P<0.05)。結(jié)論：賁門失弛緩癥動物模型食管下端存在重塑現(xiàn)象，硫化氫治療可抑制食管重塑，為硫化氫用于治療賁門失弛緩癥提供了理論依據(jù)。

賁門失弛緩癥是一種罕見的食管動力障礙性疾病[1]。食管動力障礙性疾病芝加哥分類3.0根據(jù)高分辨率食管測壓結(jié)果將其分為三個亞型，不同分型的治療手段和預(yù)后各異[2]。近年來，對賁門失弛緩癥的治療主要是以經(jīng)口內(nèi)鏡下肌切開術(shù)(peroral endoscopic myotomy, POEM)為代表的有創(chuàng)性治療，長期預(yù)后有待進(jìn)一步觀察[3]。賁門失弛緩癥的病因尚不明確，病毒感染、免疫等因素可能與其發(fā)病有關(guān)[4-5]，通過致食管壁內(nèi)神經(jīng)叢損傷，使下食管括約肌(lower esophageal sphincter, LES)松弛功能發(fā)生障礙[6-7]。與慢性心力衰竭心室重塑的病理生理學(xué)機(jī)制相似，賁門失弛緩癥患者的食管下端平滑肌呈現(xiàn)重塑現(xiàn)象[8]，包括食管下端代償性擴(kuò)張、食管壁肌層增厚并有明顯的纖維化和膠原沉積，平滑肌細(xì)胞中可見肌動蛋白等標(biāo)志物表達(dá)增高[6-9]。本實驗通過分析硫化氫治療賁門失弛緩癥動物模型對食管重塑現(xiàn)象相關(guān)標(biāo)志物肌動蛋白、彈性蛋白表達(dá)的影響，探討硫化氫在賁門失弛緩癥治療中的可能機(jī)制。

材料與方法

一、賁門失弛緩癥動物模型建立

選取30只6周齡雌性BALB/c小鼠(南京大學(xué)模式動物研究所)，初始體質(zhì)量(19.35±0.20) g，獨(dú)立適應(yīng)性飼養(yǎng)于適宜的SPF級實驗動物屏障環(huán)境中1周。1周后隨機(jī)分為模型組和對照組，每組15只，記錄初始體質(zhì)量(W0)。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，采用食管22通道水灌注高分辨率測壓系統(tǒng)(Medical Measurement Systems)記錄初始LES壓力(P0)。經(jīng)腹部正中切口暴露食管胃連接部，模型組予LES環(huán)周肌層注射10 μL芐基二甲基十四烷基氯化銨(BAC, Tokyo Chemical Industry)建立賁門失弛緩癥動物模型[10]，對照組予注射等體積0.9% NaCl溶液，逐層關(guān)閉腹腔。術(shù)后予水飼養(yǎng)1 d后恢復(fù)正常飲食飼養(yǎng)。觀察小鼠基本情況和體質(zhì)量變化，記錄術(shù)后1周、2周、3周體質(zhì)量W1、W2、W3，于第3周末再次測量LES壓力(P1)，并行食管造影檢查。完成上述檢查后處死所有小鼠，取LES處標(biāo)本行肌動蛋白、彈性蛋白免疫組化染色。

二、硫化氫治療實驗

另選取45只6周齡雌性BALB/c小鼠，獨(dú)立適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，條件如前。1周后隨機(jī)分為模型組、治療組和對照組，每組15只，記錄初始體質(zhì)量(W0)和初始LES壓力(P0)。三組動物分別予相應(yīng)實驗操作。①模型組：開腹BAC食管肌層注射+PBS腹腔注射21 d。②治療組：開腹BAC食管肌層注射+14 μmol/kg硫氫化鈉溶液(上海新華化工廠)腹腔注射21 d。③對照組：開腹0.9% NaCl溶液食管肌層注射+PBS腹腔注射21 d。BAC造模操作步驟如前所述。記錄術(shù)后1周、2周、3周體質(zhì)量W1、W2、W3，于第3周末再次測量LES壓力(P1)。完成上述檢查后處死小鼠，取LES處標(biāo)本行肌動蛋白、彈性蛋白免疫組化染色。

三、重塑標(biāo)志物免疫組化染色

小鼠LES標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、清洗等步驟后，行血清封閉并孵育；先后滴加經(jīng)稀釋的肌動蛋白抗體或彈性蛋白抗體(Abcam plc.)和相應(yīng)二抗(Roche Diagnostics)并孵育，清洗、封片、干燥后由病理醫(yī)師閱片。

結(jié)果判斷：切片置于光學(xué)顯微鏡下，每張切片隨機(jī)選取5個視野(×400)進(jìn)行觀察，目的染色顆粒為棕色顆粒。免疫組化評分按陽性染色面積在視野中所占比例分為四個等級[11]：大量明顯棕色顆粒平均散在分布于視野中(>50%)為Ⅰ級(3分)；棕色顆粒片狀分布于視野中(26%～50%)為Ⅱ級(2分)；棕色顆粒單一分布于視野中(11%～25%)為Ⅲ級(1分)；很少或完全不可見棕色顆粒(0～10%)為Ⅳ級(0分)。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、賁門失弛緩癥模型評估

造模實驗過程中，模型組和對照組小鼠均存活。模型組小鼠于食管肌層注射BAC后第2周開始出現(xiàn)進(jìn)食減少、皮毛雜亂、活動減少等表現(xiàn)，對照組小鼠較前無明顯變化。BAC處理前，兩組小鼠體質(zhì)量無明顯差異(P>0.05)；處理后1周，兩組體質(zhì)量均有所增長，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；處理后2周，模型組體質(zhì)量增長減緩，第3周較第2周下降，對照組則保持增長趨勢，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 造模實驗中模型組和對照組體質(zhì)量變化

高分辨率食管測壓結(jié)果顯示，BAC處理前兩組小鼠LES壓力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.53,P=0.96)；處理后3周末，模型組LES壓力明顯增高，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.78,P<0.05；圖1)。

1 mm Hg=0.133 kPa

綜合造模實驗前后模型組與對照組體質(zhì)量和LES壓力的變化趨勢，且模型組小鼠食管造影可見造影劑通過困難(圖2)，符合賁門失弛緩癥的相關(guān)臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征，認(rèn)為已成功建立賁門失弛緩癥小鼠模型。

A：模型組，造影劑通過困難；B：對照組，造影劑通過順利

免疫組化染色顯示，肌動蛋白、彈性蛋白染色顆粒在模型組LES中的分布明顯多于對照組，免疫組化評分明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖3、表2)，表明賁門失弛緩癥小鼠模型食管下端重塑標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，模型小鼠可能存在食管重塑現(xiàn)象。

圖3 造模實驗中模型組和對照組LES兩種重塑標(biāo)志物免疫組化染色(×400)

表2 造模實驗中模型組和對照組LES兩種重塑標(biāo)志物表達(dá)比較

二、硫化氫治療降低賁門失弛緩癥動物模型重塑標(biāo)志物表達(dá)

模型組、治療組和對照組三組小鼠硫化氫治療實驗過程中均存活，體質(zhì)量和LES壓力變化見表3。三組間術(shù)前和術(shù)后1周體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后2周三組體質(zhì)量均有不同程度的增長，模型組最緩，對照組最快，治療組居中，術(shù)后3周治療組體質(zhì)量增長慢于對照組，模型組體質(zhì)量下降，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 硫化氫治療實驗中各組小鼠體質(zhì)量和LES壓力變化

三組間術(shù)前LES壓力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；術(shù)后第3周末對照組LES壓力較前無明顯變化，模型組和治療組均有所增高，模型組增高更為顯著，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

免疫組化染色顯示，模型組和治療組LES肌動蛋白、彈性蛋白表達(dá)強(qiáng)于對照組，模型組兩者表達(dá)上調(diào)更為顯著，三組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；圖4、表4)。

對照組重塑標(biāo)志物表達(dá)最少，模型組表達(dá)最多，治療組居中

討 論

賁門失弛緩癥是一種發(fā)病率較低、病變累及平滑肌層的食管動力障礙性疾病，最常見的臨床癥狀為吞咽困難，隨著疾病的進(jìn)展，進(jìn)食梗阻癥狀逐漸加重[12]。此外，該病還存在反流、胸痛、體質(zhì)量減輕等臨床表現(xiàn)。盡管目前賁門失弛緩癥的病因?qū)W研究逐漸增多，但其病因仍未完全闡明。對賁門失弛緩癥患者食管組織的研究發(fā)現(xiàn)其LES肌間神經(jīng)叢有不同程度的不可逆性損傷，并有T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞浸潤，以及膠原組織替代神經(jīng)叢的纖維化現(xiàn)象[6-7]，因此有學(xué)者提出賁門失弛緩癥患者的食管下端存在重塑現(xiàn)象[8]。與慢性心力衰竭患者發(fā)生心室重塑相似，食管重塑是對賁門失弛緩癥病理狀態(tài)的代償性反應(yīng)。在各種原因?qū)е禄颊週ES肌間神經(jīng)叢受損后，LES松弛功能障礙，持續(xù)高壓，即食管下端后負(fù)荷增加；LES無法正常松弛，日常進(jìn)食的食物逐漸堆積于食管下端，所形成的壓力隨之升高，即食管下端前負(fù)荷增加；LES肌細(xì)胞進(jìn)行性代償性增大、增多，組織中膠原成分增多，食管壁增厚、變硬[8]，提示發(fā)生食管重塑。作為組織重塑的標(biāo)志物，肌動蛋白和彈性蛋白在肺血管重塑動物模型中表達(dá)增高[13]。本實驗對賁門失弛緩癥小鼠模型和對照組小鼠的LES組織進(jìn)行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)前者肌動蛋白和彈性蛋白表達(dá)均顯著增高，提示模型小鼠LES處可能存在組織重塑現(xiàn)象。

表4 硫化氫治療實驗中各組LES兩種重塑標(biāo)志物表達(dá)比較

硫化氫是繼一氧化碳、一氧化氮之后第三個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性氣體信號分子，在體內(nèi)系由左旋半胱氨酸經(jīng)催化后合成，研究[14]發(fā)現(xiàn)其可與一氧化氮協(xié)同調(diào)節(jié)平滑肌張力，具有松弛平滑肌的作用，是一種新型的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。筆者所在團(tuán)隊曾對賁門失弛緩癥患者食管組織中硫化氫合成酶減少的現(xiàn)象進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)硫化氫可劑量依賴性地抑制食管收縮活性，內(nèi)源性硫化氫合成減少參與了賁門失弛緩癥的發(fā)生[15-16]。近年關(guān)于硫化氫在血管生理學(xué)中作用的研究逐漸增多[17]，其中包括硫化氫對肺動脈高壓患者肺血管重塑的改善作用[18]。本研究予賁門失弛緩癥小鼠模型腹腔注射外源性硫化氫供體硫氫化鈉，觀察其對食管重塑的影響。實驗結(jié)果顯示，與未予硫化氫治療的模型小鼠相比，經(jīng)硫化氫治療21 d的模型小鼠LES重塑標(biāo)志物肌動蛋白、彈性蛋白表達(dá)明顯減少，提示硫化氫治療可改善賁門失弛緩癥食管重塑現(xiàn)象，同時模型小鼠的LES壓力升高和體質(zhì)量減輕亦明顯好轉(zhuǎn)，為硫化氫治療賁門失弛緩癥提供了實驗依據(jù)。

綜上所述，賁門失弛緩癥動物模型食管下端存在重塑現(xiàn)象，硫化氫治療可抑制食管重塑。本實驗為初步研究，未進(jìn)一步分析其他食管重塑相關(guān)指標(biāo)，亦未明確食管組織中的硫化氫水平，有待后續(xù)實驗加以完善。此外，尚需深入探討硫化氫作用于食管重塑的具體機(jī)制，為硫化氫用于治療賁門失弛緩癥提供更多理論依據(jù)。