陳應娥，梁巧蘭，劉耀霞，王鑫偉，王興鐸，雷 雪，管亮亮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院/甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

飼用玉米是一種優(yōu)良的飼料作物，是重要的青貯飼料，對畜牧業(yè)的發(fā)展具有決定性的重要作用[1-2]。其鮮草葉片柔軟、莖稈挺立、糖分含量高、生物產(chǎn)量高、適口性好、消化率高、飼用價值高，適于青貯或青貯飼用，適應種植范圍廣[3]。草產(chǎn)量可以達到1.5×105kg/hm2，發(fā)展飼用玉米生產(chǎn)，既可以調整種植業(yè)結構，避免種植結構單一，也可為當?shù)氐娘暳霞庸て髽I(yè)提供原材料，為養(yǎng)殖企業(yè)提供優(yōu)良的鮮草與青貯飼料，提高農(nóng)民的收益，促進當?shù)亟?jīng)濟的發(fā)展[4]。隨著甘肅省草牧業(yè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，飼用玉米日益受到人們的重視，種植面積逐漸增加，但是連作造成玉米根腐病 (maize root rot)發(fā)生嚴重，病害發(fā)生后植株莖葉暗綠，病葉自葉尖向下或從邊緣逐漸變黃干枯，須根初期表現(xiàn)為水漬、變黃，后腐爛壞死，造成幼苗枯死，嚴重影響玉米生產(chǎn)[5]。有關甘肅省飼用玉米根腐病研究尚未見報道。為此，試驗對引起甘肅省飼用玉米根腐病的病原菌及其生物學特性和有效防治藥劑進行了研究和篩選，以期對玉米根腐病的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

玉米根腐病病樣采自甘肅省古浪縣發(fā)病的玉米田；供試培養(yǎng)基選用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂17 g)、玉米培養(yǎng)基(玉米300 g,瓊脂16 g)、PSA培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂17 g)、胡蘿卜培養(yǎng)基(胡蘿卜200 g，糖20 g，瓊脂15 g)[6]；試驗儀器為超凈工作臺、滅菌鍋、顯微照相機、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平等；供試藥劑(表1)。

表1 供試藥劑及推薦使用濃度

注：供試藥劑8%惡霉靈為水劑，其他供試藥劑都為可濕性粉劑，下同

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離純化 在無菌條件下用剪刀在病健交界處剪1 mm×1 mm的方塊，置于按表1配方制備滅菌的PDA培養(yǎng)基平板上，在25℃的恒溫條件下培養(yǎng)，當培養(yǎng)出的菌落直徑生長至1 cm時，用接種針挑取菌落邊緣的菌絲置入另一皿PDA培養(yǎng)基內進行純化培養(yǎng)，純化后采用單孢分離法對分離菌進一步純化，純化后分離物移入試管斜面培養(yǎng)基中，待長出菌絲后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹7-9]，并觀察記錄分離菌的培養(yǎng)形態(tài)。

1.2.2 分離物致病性測定 用打孔器打取在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d菌餅，接種到健康的玉米幼苗莖基部，以昆蟲針刺傷玉米幼苗莖基部作“有傷接種”、以不刺傷作“無傷接種”，以接同樣大小的PDA菌餅作對照，每處理3株幼苗，重復3次。置于相同條件下培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況，判斷被接菌種致病能力的大小，并從接種后發(fā)病的玉米苗上進行病原菌分離，進一步確定分離物是否為致病菌。

1.2.3 病原菌鑒定 將致病性測定中分離出的致病性明顯病原菌在顯微鏡下觀察并記錄其菌落特征，菌絲、孢子形態(tài)等。依據(jù)文獻[10-11]的方法鑒定病原物類型，并將病原物形態(tài)特征進行顯微照相。

1.3 病原菌生物學特性測定

1.3.1 不同培養(yǎng)基對病原物的生長 從發(fā)病程度嚴重的玉米苗上分離出的病原菌置于25℃條件下培養(yǎng)4 d，再用d=5 mm的打孔器打取菌餅，分別接入按照上述配方配置并經(jīng)高壓滅菌的PDA培養(yǎng)基、胡蘿卜培養(yǎng)基、玉米培養(yǎng)基、PSA培養(yǎng)基中央，每處理3次重復。25℃條件下置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)4 d后觀察原物菌絲生長的狀態(tài)及形態(tài)顏色，用十字交叉法測量菌落直徑[12-13]，比較幾種培養(yǎng)基對病原物菌絲生長的影響。

1.3.2 不同溫度對病原物的生長 用打孔器于培養(yǎng)4 d的菌落邊緣打取5 mm菌餅接種到滅菌的PDA平板上分別置于10、15、20、25、30、35℃條件下培養(yǎng)，每處理重復3次。4 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，比較不同溫度對病原物菌絲生長的影響。

1.3.3 不同光照條件對病原物的生長 用打孔器取5 mm的菌餅接種到滅菌PDA平板上，分別放置于12 h光暗交替、24 h光照和24 h黑暗3種光照處理下，重復3次，4 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4 病原菌室內藥劑篩選及毒力測定

采用生長速率法[14]對主要致病菌進行室內藥劑篩選。用無菌水將各藥劑按表1中的濃度擴大50倍配制成藥液，然后將藥液按對半稀釋法稀釋成5個濃度，將配好的藥劑吸取1 mL加入到49 mL滅菌冷卻到45℃的PDA中，將其倒入滅菌后的4個培養(yǎng)皿上，制成含藥培養(yǎng)基，并做好標記。將培養(yǎng)4 d后的病原菌用打孔器打取5 mm的菌餅，將菌餅接到含藥PDA上，置于25℃的條件下培養(yǎng)，以加1 mL滅菌水的PDA培養(yǎng)基作為對照，每個處理重復4次，96 h后十字交叉法測量菌落直徑，并計算抑菌率。

抑菌率(%)=

根據(jù)藥劑濃度對數(shù)(橫坐標)及對應的菌絲生長抑制率概率值(縱坐標)作回歸分析，求出毒力回歸方程y=a+bx，并計算出藥劑抑制濃度(EC50)和相關系數(shù)，根據(jù)EC50評價殺菌劑毒力大小。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 田間癥狀觀察 調查發(fā)現(xiàn)，感病玉米葉片卷曲發(fā)黃，毛根減少，根尖變鈍，植株萎蔫(圖1)。

2.1.2 病原菌分離純化 從玉米根腐病根部分離得到的真菌在PDA上的培養(yǎng)形態(tài)為菌絲稀疏突起羊毛狀。菌落粉白色至肉色，由于大量孢子生成而呈粉質。大型分生孢子香腸形，頂細胞短、鈍圓，少許有彎曲，通常3～4個隔膜或不清，大小為26.44～39.61 μm×4.17～5.92 μm ；小型分生孢子數(shù)量多,橢圓形和卵形，無分隔，大小為5.54～8.12 μm×2.32～3.87 μm(圖2)。

2.1.3 分離物致病性測定及鑒定 將分離菌通過有傷和無傷接種到玉米莖基部后，發(fā)現(xiàn)玉米苗均有所感病，6 d時葉部逐漸變軟、萎蔫、黃化，根系逐漸變褐，變軟。15 d時觀察發(fā)現(xiàn)有傷接種的苗子植株矮小甚至直接枯死，根部有腐爛，發(fā)病程度明顯比無傷接種嚴重。同時從發(fā)病玉米莖基部均能分離到與接種菌在PDA上培養(yǎng)形態(tài)一致的病原菌。經(jīng)培養(yǎng)形態(tài)觀察和致病性測定，結合真菌鑒定手冊將分離物鑒定為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。

圖1 玉米根腐病田間癥狀Fig.1 Symptoms of maize root rot disease in field

圖2 分離物培養(yǎng)形態(tài)及孢子形態(tài)Fig.2 Morphology and spore morphology of isolated fungi

2.2 茄病鐮刀菌生物學特性研究

2.2.1 不同培養(yǎng)基對茄病鐮刀菌生長的影響 通過不同培養(yǎng)基對病原菌的生長試驗，結果表明茄病鐮刀菌在PDA培養(yǎng)基上生長最好，其菌落平均直徑達到80.67 mm，其次是PSA培養(yǎng)基，測得菌落平均直徑75.83 mm。4種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑之間差異極顯著(P<0.01)(圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)基處理下茄病鐮刀菌的生長Fig.3 Effect of different media on the growth of Fusarium solani注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同

2.2.2 不同溫度對茄病鐮刀菌生長的影響 茄病鐮刀菌在10～35℃均能生長，較適生長為25～30℃。其中，30℃條件下菌絲生長狀況最好，菌落直徑達到84 mm，25℃菌落直徑為81 mm，15～30℃溫度條件下菌落直徑間差異極顯著(P<0.01)，10℃和30℃下菌落直徑間差異不顯著(圖4)。

圖4 溫度處理下茄病鐮刀菌的生長Fig.4 Effect of temperature on the growth of Fusarium solani

2.2.3 不同光周期條件對茄病鐮刀菌生長的影響 不同光周期條件對茄病鐮刀菌的生長試驗表明，光照對茄病鐮刀菌菌絲生長的影響不大，培養(yǎng)4 d后菌落直徑在12 h光暗交替條件下最大，為76.00 mm，24 h黑暗條件下菌落直徑最小，為73.02 mm ，24 h全光照條件下的菌落直徑介于二者之間，為74.00 mm，不同光照條件下12 h光暗交替和其他兩個光照條件處理的菌落直徑之間差異極顯著(P<0.01)(圖5)。

圖5 光照處理下茄病鐮刀菌的生長Fig.5 Effect of light on the growth of Fusarium solani

2.3 6種殺菌劑對茄病鐮刀菌抑菌作用及毒力測定

6種藥劑對茄病鐮刀菌的抑制作用測定表明，8%惡霉靈對茄病鐮刀菌的抑制效果最好，抑菌率為92.68%，其次抑菌效果較好的是80%多菌靈和75%百菌清，抑菌率分別為88.57%和85.33%，最差的是70%代森錳鋅，其抑菌率僅為49.43%，6種殺菌劑對茄病鐮刀菌的抑制率之間差異極顯著 (表2)。毒力測定結果表明，8%惡霉靈毒力最大，EC50值為28.50 μg/mL，50%福美雙劑毒力最小，EC50值為320.50 μg/mL，其他4種藥劑的毒力介于二者之間(表3)。

3 討論

20世紀90年代中期，玉米苗期病害在各玉米產(chǎn)區(qū)逐漸由次要病害上升為主要病害，重病地塊病株率高達100%，嚴重時全田死苗，造成毀種，成為玉米生產(chǎn)上的新障礙。玉米苗期根腐病是玉米苗期的重要病害之一，可造成田間大量死苗，重病地塊發(fā)病率達80%，且有逐年加重趨勢，給玉米生產(chǎn)造成嚴重危脅[15-16]。國外報道引起玉米根腐病的病原菌有禾生腐霉菌(Pythiumgraminicola)、禾谷鐮刀菌(fusariumgraminearum)、蠕孢菌 (Bipolarissorokinianum)，主要病原菌為腐霉菌(Pythiumgraminicola)和鐮刀菌(Fusariumgraminearum)，國內報道的病原菌串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、串珠鐮刀菌膠孢變種(fusariummoniliformevar.subglutinans)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、蠕孢菌 (Bipolarissorokinianum)、腐霉菌(Pythiumgraminicola)、絲核菌(Rhizoctonia)等[17-18]。玉米莖腐病、穗腐病和苗期根腐病是危害玉米的3種重要病害，過去一直進行單獨研究。玉米苗期根腐病的研究相對較少，是由多種病原菌復合侵染引起。總之由于地理及氣候條件的差異，各地區(qū)對于引起玉米根腐病的病原菌的說法各不一樣，在我國南方比較潮濕的地區(qū)報道較多的是腐霉菌(Pythium)，而在北方較干旱地區(qū)多為鐮刀菌(Fusarium)[19-20]。試驗通過對甘肅省種植的飼用玉米根腐研究發(fā)現(xiàn)病原菌為茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)。生物學特性研究發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌的最適培養(yǎng)基為PDA，最適生長溫度為30℃，光暗交替有利于該菌的生長；8%惡霉靈水劑、80%多菌靈可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑對茄病鐮刀菌有較好的抑制效果，抑菌率分別為92.68%，88.57%和85.33%。EC50分別為28.50，45.50和97.50 μg/mL，可用于田間防治；有研究表明利用以化學農(nóng)藥為主要成分的武將450FS懸浮種衣劑、種子包衣劑處理種子可有效防治苗期根腐病[18,20-21]，木霉菌顆粒劑和種衣劑通過土壤穴施和種子包衣可有效防治玉米莖腐病和紋枯病，其中木霉菌顆粒劑防效達65%、87%[21]。而試驗針對甘肅省飼用玉米根腐病病原菌僅分離得到一種強致病菌，對于是否存在其他病原菌、篩選的幾種藥劑的田間防效及其他種子包衣劑、生物農(nóng)藥的抑菌作用及防治效果等問題還有待進一步研究。

表2 6種殺菌劑對玉米根腐病菌的抑菌作用

注：同列不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P≤0.01)

表3 6種殺菌劑對茄病鐮刀菌的毒力

4 結論

通過研究發(fā)現(xiàn)引起甘肅省古浪縣飼用玉米根腐病的病原菌為茄病鐮刀菌；該病原菌菌絲最適生長溫度為30℃，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，12 h光照、12 h黑暗交替有利于該菌的生長；6種殺菌劑對玉米根腐病均有抑菌效果，其中8%惡霉靈、80%多菌靈、75%百菌清抑制率均在85%，分別為92.68%，88.57%和85.33%。EC50分別為28.50，45.50和97.50 μg/mL；該試驗結果對指導古浪縣飼用玉米根腐病有效防治具有重要意義。