馬金鳳，劉雪兒，楊成德，李統(tǒng)華，金夢軍

(甘肅農業(yè)大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

土壤微生物是地下生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物因子，對農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的能量流動、物質循環(huán)及穩(wěn)定性有重要作用，其受根系分泌物的影響，根際土壤微生物種類和數(shù)量具有強烈的根際效應[1]。越來越多的證據(jù)顯示[1]，根際土壤微生物的數(shù)量、種類、代謝活性及微生物間的相互作用決定著植物的健康狀況，植物與其生長的土壤之間存在反饋調節(jié)的關系，且部分土壤細菌具有固氮、溶磷，促進植物生長、抗逆境、抗病蟲害和生物修復等多方面功能，使植物受益。目前，植物病害主要利用化學農藥防治，盡管效果良好，但化學防治會引起植物病原抗藥性和農藥殘留等問題，造成了環(huán)境污染和生態(tài)破壞[2]，而生物防治既可取得良好的防治效果，又能克服諸多缺點，已成為目前研究熱點。其中，利用生防細菌防治植物病害是生物防治的一個主要內容。生防細菌防治植物病害發(fā)生發(fā)展的一個重要機制是產生拮抗物質[3]，且拮抗物質種類多，作用范圍廣譜。近年來有關植物病害生防細菌的研究越來越多，特別是東祁連高寒草地牧草內生細菌拮抗功能有較多報道[4-6]，但是對青海高寒極端生境土壤細菌的抑菌能力如何，相關報道較少。因此，試驗擬采用平板對峙法評價青海高寒草地青藏苔草根圍土壤細菌的拮抗能力，結合形態(tài)特征并利用16S rDNA基因序列對其進行鑒定，以期為高寒草地微生物資源開發(fā)利用提供依據(jù)，也為微生物菌劑的研發(fā)提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 分離自青海高寒草地青藏苔草根際的土壤細菌；供試病原菌為番茄早疫病菌、馬鈴薯壞疽病病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯枯萎病菌，由甘肅農業(yè)大學植物病理實驗室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基和Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基用于菌種的純化和保存；馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基用于植物病原真菌的培養(yǎng)和對峙培養(yǎng)試驗[7]。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤細菌的分離和純化 將10 g土壤樣置于90 mL無菌水中，在28℃的搖床上振蕩30 min，濃度梯度稀釋，取稀釋的土壤懸液0.1 mL涂布在固體LB平板上，在28℃條件下培養(yǎng)48 h，挑取培養(yǎng)特征明顯相異的單個菌落，劃線于LB平板進行純化，純化后于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 土壤細菌的培養(yǎng)性狀及形態(tài)觀察 制備LB培養(yǎng)基，通過劃線培養(yǎng)菌株，2 d后觀察平板上菌落形狀、大小和顏色，18～24 h菌齡進行革蘭氏染色，并進行顯微觀察、拍照和測量30個菌體的大小[7-10]。

1.2.3 拮抗功能評價 以4種病原菌為指示菌，采用對峙培養(yǎng)法評價拮抗功能。在25℃下將4種指示菌分別在PDA平板上活化培養(yǎng)7 d，土壤細菌在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)24 h，用直徑為6 mm的打孔器在病原真菌平板上打取指示菌菌餅并接入PDA平板中央，再將土壤細菌點接在距菌餅2.5 cm處，每平板接4點，另在距菌餅2.5 cm處點接無菌水做對照，重復3次，于28℃培養(yǎng)5 d后用十字交叉法測量抑菌圈直徑并計算抑菌率，根據(jù)抑菌率評價拮抗功能[7-10]。

抑菌率=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-0.6)]×100%

1.2.4 16S rDNA序列鑒定 按天根生化科技有限公司提供的試劑盒(離心柱型細菌基因組DNA抽提試劑盒；目錄號DP302)提取DNA，采用細菌16S rDNA通用擴增引物27 F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′進行PCR擴增。擴增體系為 DNA模板2 μL，MasterMix 25 μL，1492R 2 μL，27F 2 μL，ddH2O 19 μL。反應條件為：95℃預變性4 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。經1%瓊脂糖凝膠電泳純化的PCR產物送武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，將所得序列在NCBI的GenBank中進行Blast對比，選取與各菌株相似性較高的細菌菌株的16S rDNA序列，用Mega(7.0)軟件中的鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確系統(tǒng)發(fā)育信息。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)運用 Excel 2010和Mega 7.0軟件進行處理比對。

2 結果與分析

2.1 土壤細菌的分離和純化

對青海高寒草地青藏苔草根圍土壤細菌分離培養(yǎng)和純化，其土壤細菌含菌量為1.8×107CFU/g，細菌數(shù)量豐富，但根據(jù)培養(yǎng)性狀共分離到8株細菌，種類較單一，分別編號為1T1、1T2、1T3、1T4、1T5、1T6、1T7和1T8，其中1T5在28℃下經幾次轉接后不能生長。

2.2 土壤細菌的形態(tài)觀察

2.2.1 培養(yǎng)形狀觀察 1T1：菌落直徑1.5 mm，呈不規(guī)則圓形，皺紋狀凸起，邊緣不整齊，不透明，無光澤，較干燥，白色；1T2：菌落直徑1.8 mm，呈圓形，稍凸起，邊緣整齊，不透明，有光澤，乳白色；1T3：菌落直徑2 mm，呈圓形，乳狀凸起，邊緣整齊，不透明，無光澤，粗糙，較干燥，乳白色；1T4：菌落直徑2.5 mm，呈不規(guī)則圓形，邊緣不整齊，表面褶皺，中心凹陷，呈草帽狀，不透明，無光澤，白色；1T6：菌落直徑1 mm，呈圓形，邊緣整齊，菌落稍凸起，不透明，有光澤，乳白色；1T7：菌落直徑1.5 mm，呈圓形，邊緣整齊，較平展，不透明，有光澤，乳白色；1T8：菌落直徑3 mm，呈圓形，邊緣整齊，較平展，不透明，有光澤，乳白色(圖1)。

2.2.2 菌體形態(tài)觀察 7株土壤細菌均呈革蘭氏陽性(圖2)， 1T8菌體為球形，直徑為2.25 μm，其余均為桿狀，其中1T2菌體最長，達9.07 μm，寬為2.46 μm，1T7最短，長為2.88 μm，寬為1.07 μm，其他菌株長和寬均介于兩者之間(表1)，表現(xiàn)出明顯的形態(tài)多樣性。

表1 土壤細菌的形態(tài)特征

圖1 土壤細菌菌落形態(tài)Fig.1 The conoly characteristics of soil bacteria

圖2 土壤細菌的革蘭氏染色Fig.2 The gram stains of soil bacteria

2.3 拮抗功能評價

結果表明，土壤細菌1T4對供試病原真菌均有拮抗作用， 1T8對番茄早疫病菌和馬鈴薯壞疽病菌有拮抗作用(圖3，4)，其中1T4和1T8對番茄早疫病菌的抑菌率分別為67.1%和65.7%，對馬鈴薯壞疽病菌的抑菌率分別為61.4%和54.3%；1T4對馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯炭疽病的抑菌率分別為62.9%和75.7%；1T1、1T2、1T3、1T6和1T7對4種指示菌沒有拮抗作用(表2)。

表2 7株土壤細菌對4種病原菌的抑菌率

圖3 1T4和1T8對番茄早疫病菌的拮抗作用Fig.3 The antagonism of 1T4 and 1T8 against Alternaria solani

圖4 1T4和1T8對馬鈴薯壞疽病菌的拮抗作用Fig.4 The antagonism of 1T4 and 1T8 against Phoma foveata

2.4 16S rDNA序列鑒定

采用細菌16S rDNA通用引物，對有抑菌作用的細菌進行PCR擴增，并將細菌擴增結果送至武漢金開瑞生物工程有限公司進行測序，測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast對比，選擇與對比菌株同源性大于99%的菌株，使用MAGE7軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果顯示，在系統(tǒng)發(fā)育樹中1T1與Pseudomonascorrugata(MF077203.1)的同源性達 100%，且聚于同一分支上(圖6)，結合形態(tài)特征將1T1初步鑒定為Pseudomonascorrugata；1T3與Pseudomonasbrassicacearum(KX984045.1)的同源性達99%，且聚為一類，初步鑒定為Pseudomonasbrassicacearum；1T4與解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens的兩個菌株MG937572.1和KY271752.1的同源性達99%，且聚為一類，初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens；1T2，1T6和1T8與腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophyticus的兩個菌株CP02209 3.2和CP014113.2的同源性達99%，并聚為一類，初步鑒定為腐生葡萄球菌Staphylococcussaprophyticus。

圖5 青藏苔草根圍土壤細菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 16SrDNA phylogenetic tree of soil bacteria

3 討論

目前報道的生防細菌主要集中在類芽孢桿菌[11]、假單胞菌[12]和芽孢桿菌[13]等，如枯草芽孢桿菌C-22對棉花炭疽病菌、枯萎病菌、立枯病菌、黃萎病菌、棉花疫霉病菌和棉花葉斑病菌均有較好的抑制作用[14]；枯草芽孢桿菌OBS -2對尖鐮孢香草蘭?；透ょ犳呔a生明顯的拮抗帶，具有實際應用價值[14]。試驗從青藏苔草根圍土壤細菌分離到的1T4病原鑒定為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens，對番茄早疫病菌、馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌和馬鈴薯炭疽病菌均有拮抗能力，抑菌率在61.4%，與報道的芽孢桿菌對植物病原真菌具有較強拮抗能力的結果一致[11,15]。芽孢桿菌能夠抑制的植物病害比較全面，包括植株的各個部分，例如植物地上部分的枝葉、果實及地下部分的根部等[16]，芽孢桿菌屬被研究用作生防菌劑的菌種有很多，其中被報道較多的有解淀粉芽孢桿菌[17]。肉桂醛[18]、廣藿香精油[19]、木犀草素[20]等對金黃色葡萄球菌的抑菌作用及抑菌機制方面的報道較多，而葡萄球菌抑菌作用的研究較少，試驗將1T8初步鑒定為腐生葡萄球菌，且其對番茄早疫病菌和馬鈴薯壞疽病菌的抑菌率分別為65.7%和54.3%。從生防菌分離的區(qū)域分析，植物根際土壤仍然是生防菌分離的重點區(qū)域[14]，但有關極端環(huán)境土壤中生防菌的報道較少，因此，研究以馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯枯萎病菌和番茄早疫病菌為指示菌，評價青海高寒草地極端生境青藏苔草根圍土壤細菌的拮抗能力，為高寒草地微生物資源開發(fā)利用提供依據(jù)，也為微生物菌劑的研發(fā)提供菌種資源。

4 結論

從青海高寒草地青藏苔草根圍土壤樣品中分離到8株土壤細菌，其中1T5在28℃下經幾次轉接后不能生長，解淀粉芽孢桿菌1T4對番茄早疫病菌、馬鈴薯壞疽病菌、馬鈴薯炭疽病菌和馬鈴薯枯萎病菌的抑菌率分別為67.1%、61.4%、75.7%和69.2%；腐生葡萄球菌1T8對番茄早疫病菌及馬鈴薯壞疽病菌的抑菌率分別為65.7%和54.3%。試驗結果表明高寒草地牧草根圍土壤細菌中具有良好抑菌能力的菌株，是一個巨大的微生物資源庫。