劉歡妹，靖長友，張曙光，王雪，張鑫鑫，于勝吉

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院骨科，北京 100021

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類以共價鍵結構形成，不具有3'和5'末端頭尾結構的環(huán)狀長鏈非編碼RNA。circRNA因其閉環(huán)環(huán)狀結構對核酸外切酶具有較高的耐受性，不易被降解，因此，可穩(wěn)定存在于真核生物細胞的細胞質中。1976年，Sanger等[1]利用電子顯微鏡首先在植物感染的病毒顆粒中觀察到了共價閉合環(huán)裝RNA分子，并將其命名為circRNA。circRNA最初被認為是RNA剪接過程中產生的無功能產物。隨著高通量測序技術和生物信息學的發(fā)展，circRNA在基因轉錄、轉錄后修飾及翻譯調控中的作用逐漸被證實。circRNA在神經系統(tǒng)疾病、心血管疾病和腫瘤等領域均積累了一定的研究成果，這提示circRNA具有疾病特異性。乳腺癌、肝癌、膠質瘤和結直腸癌等惡性腫瘤中均存在circRNA的異常表達，circRNA可成為潛在的腫瘤疾病診斷指標和治療靶點。本文就circRNA的生物學特征及其在腫瘤領域的研究進展進行綜述。

1 circRNA 的生成與降解

circRNA是由特殊的前體mRNA通過可變剪接產生的。根據前體mRNA的不同，circRNA可分為外顯子circRNA、內含子circRNA、外顯子-內含子circRNA和基因間型circRNA[2]。外顯子circRNA的形成機制為套索驅動的環(huán)化和內含子配對驅動的環(huán)化[3]，前者是指一個外顯子的3'剪接供體與另一個外顯子的5'剪接受體共價結合后切除內含子，然后形成circRNA；后者是指由兩個內含子先通過堿基互補配對形成環(huán)狀結構，再切除內含子，最后形成circRNA。內含子circRNA由內含子獨立環(huán)化而來，其結構的形成依賴于含有鄰近5'剪接位點處的7個核苷酸GU富集元件和3'剪接位點處的11個核苷酸C富集元件[4]。某些環(huán)化的外顯子中間保留有內含子，此類circRNA為外顯子-內含子circRNA。circRNA具有特異的內切酶位點，可通過堿基互補的方式調控靶基因mRNA的翻譯或降解[5]。有研究發(fā)現，在哺乳動物細胞內，circRNA通過進入細胞外囊泡的方式進行清除[6]，但該研究為體外實驗，關于人體內circRNA的降解機制尚待進一步研究。

2 circRNA 的生物學功能

2.1 miRNA 的海綿作用

微小RNA（microRNA，miRNA）是內源性非編碼雙鏈線性RNA，具有一定的分子特異性和靶向性，是基因轉錄后調控的重要元件，可競爭性結合并降解靶mRNA，從而影響疾病的發(fā)生與發(fā)展。circRNA可與相應的miRNA競爭性結合，從而調控靶基因的表達。Hansen等[7]在人和小鼠的大腦中發(fā)現了一種高表達的circRNA，即ciRS-7，并證實miRNA-7的環(huán)狀RNA海綿（circular RNA sponge for miRNA-7，ciRS-7）包含70多個選擇性保守的miRNA靶位點，可明顯抑制miRNA-7的表達。circRNA腦降解相關蛋白1（cerebellar degeneration-related protein 1，CDR1）/ciRS-7的過表達上調了miRNA靶基因的表達，而敲除它具有相反的作用；同時證實睪丸特異性circRNA Sry9是一種miRNA-138海綿，表明circRNA產生的miRNA海綿作用是一種普遍現象，這也是首次對circRNA自然表達功能進行分析的研究。Hairong等[8]研究表明，競爭性內源RNA ciRS-7可通過調控其靶點miRNA-7/KLF4和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號途徑促進食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）細胞的遷移和侵襲，表明circRNA作為競爭性內源RNA（competitive endogenous RNA，ceRNA）與miRNA競爭性結合，對上下游的基因通路進行調控，從而調控基因的表達。

2.2 翻譯蛋白

circRNA為非編碼RNA。有學者認為，理論上通過插入病毒內部核糖體始動位點，將circRNA翻譯成多肽或蛋白質，這從circRNA結構上是可以實現的[9]。Yang等[10]研究證實，circRNA可以通過堿基修飾的N6-甲基腺苷（m6A）位點驅動轉錄起始，翻譯蛋白。Legnini等[11]通過對人和鼠的肌細胞體外分化過程中的circRNA進行高通量基因組測序及對其表達譜進行分析發(fā)現，circ-ZNF609可特異性控制成肌細胞的增殖。circ-ZNF609包含開放閱讀框，與線性轉錄相同，從起始密碼子開始，終止于終止密碼子，且認為circ-ZNF609翻譯蛋白質的功能與其含有核糖體結合位點有關，提供了真核生物中circRNA編碼蛋白的有力證據。叉頭框蛋白O3（forkhead box O3，FOXO3）在腫瘤的進展中起重要作用，Du等[12]發(fā)現circ-FOXO3是一種circRNA，其作為一種內源性細胞質，可以與E3泛素蛋白連接酶MDM2結合，并調節(jié)其在多泛素化修飾和降解靶蛋白中的作用，從而發(fā)揮促進、定位和管理蛋白質的功能。因此，越來越多的研究證實了circRNA可結合并編碼蛋白從而發(fā)揮生物學效應。

2.3 調節(jié)RNA 結合蛋白

RNA結合蛋白（RNA binding protein，RBP）在轉錄后基因表達的調節(jié)中起著重要作用，可發(fā)揮RNA選擇性剪接、維持RNA穩(wěn)定、RNA轉運和翻譯等多種生物學功能，并參與細胞的增殖、分化、遷移、衰老、凋亡及對氧化應激的細胞應答。有研究表明，circRNA可競爭性結合RBP，充當RBP的海綿，從而改變剪接模式或mRNA的穩(wěn)定性。與對應的線性mRNA相比，circRNA上的RBP結合位點較少，但仍有證據證實circRNA與RBP具有相互作用的關系。這可能是因為circRNA可以采用與相同序列的相關線性分子不同的三級結構，或者可通過circRNA中結合在一起的序列產生新的蛋白結合位點[12]。另外，circRNA還可調控RBP的表達，且由腫瘤抑制因子WWOX的親本基因編碼的2個circRNA（KIRKOS-73和KIRKOS-71）可以調節(jié)p53的生成。同時新的研究結果表明，hsa_circ_0055538通過p53/Bcl-2/caspase信號通路參與口腔鱗狀細胞癌的進展[13]。

2.4 調控親本基因表達

研究表明，circRNA在轉錄后和基因表達的調控中起著舉足輕重的作用，在人類細胞中發(fā)現一類與RNA聚合酶Ⅱ（polymeraseⅡ，PolⅡ）相關的一類circRNA，其結構為內含子循環(huán)包繞外顯子，即外顯子-內含子circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）。EIciRNA主要定位于細胞核內，與U1核小核糖核蛋白（U1 small nuclear ribonucleoprotein，U1 snRNP）顆粒和RNA PolⅡ相互作用，促進其親本基因的轉錄[14]。

3 circRNA 在腫瘤中的研究

3.1 乳腺癌

近年來，越來越多的研究報道circRNA在乳腺癌的發(fā)生、侵襲和轉移過程中異常表達。Smid等[15]分析了348例原發(fā)性乳腺癌的RNA序列數據，最后確定了95 843個circRNA，其中20 441個circRNA是已知的。在與同一基因外顯子邊界相匹配的環(huán)狀結構中，668個circRNA與線性基因表達水平的相關性較差甚至呈負相關；同時，確定了與乳腺癌亞群相關的circRNA表達譜，并進行了詳細的生物信息學分析；驗證了敲除siRNA介導的circCONT2基因可明顯降低乳腺癌細胞系MCF-7和BT-474的存活率，從而證實了circRNA的生物學功能。Yin等[16]將乳腺癌患者和健康志愿者的血液進行了circRNA芯片測序，結果顯示，共19種circRNA的表達上調，22種circRNA的表達下調，并通過繪制乳腺癌表達譜，認為hsa_circ_0001785可作為診斷乳腺癌的分子標志物；通過對三陰性乳腺癌患者的乳腺癌組織進行circRNA芯片測序發(fā)現，circEPSTI 1（hsa_circRNA_000479）明顯升高。Chen等[17]進行的體內試驗表明，circEPSTI1與miRNA-4753、miRNA-6809結合可發(fā)揮海綿的作用，調節(jié)bcl11a的表達，從而影響腫瘤壞死因子的增殖和凋亡。Liu 等[18]研 究證實 circRNA-MTO1（hsa_circRNA_007874）與腫瘤壞死因子受體相關因子4（tumor necrosis factor receptor associated factor 4，TRAF4）相互作用，阻斷了TRAF4激活Eg5翻譯，從而抑制了Eg5蛋白的表達水平，并降低了乳腺癌細胞的活力，這些通路有望成為乳腺癌靶向治療的新靶點。

3.2 肺癌

Zhu等[19]通過對肺癌組織進行circRNA測序發(fā)現，39個circRNA的表達上調，20個circRNA的表達下調。其中hsa_circ_0013958的表達明顯上調，并能夠促進肺癌細胞的增殖、侵襲，并抑制其凋亡，可作為肺癌早期篩查的重要指標。Tan等[20]研究證明F-circEA-4a是由EML4-ALK-v3b后剪接產生的促腫瘤型的circRNA，是一種新型的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）生物標志物；此外，EML4-ALK-v3b衍生的circRNAF-circEA-2a主要位于細胞質內，可促進NSCLC細胞的遷移和侵襲，但對NSCLC細胞增殖的影響較??；而F-circEA-2a存在于腫瘤中，而不存在于EML4-ALK融合基因的NSCLC患者的血漿中，進一步支持了F-circEA-4a對EML4-ALK陽性NSCLC的診斷價值。circRNA是肺癌的重要分子標志物，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。Wang等[21]研究證實了circPTK2（hsa_circ_0008305）對 miRNA-429/miRNA-200b-3p的海綿作用，可通過控制轉錄中介因子 1-γ（transcriptional intermediary factor 1-γ，TIF1γ）抑制TGF-β誘導的上皮-間充質轉化和NSCLC細胞的轉移，且表明circPTK2過表達對NSCLC的轉移具有抑制作用。

3.3 結直腸癌

Jim等[22]研究發(fā)現hsa_circ_0136666可通過競爭性結合結直腸癌細胞中的miRNA-136從而上調SH2B1的表達；SH2B1的過表達可逆轉hsa_circ_0136666對結直腸癌進展的抑制作用，表明hsa_circ_0136666可通過miRNA-136/SH2B1軸促進結直腸癌的進展。Li等[23]研究發(fā)現，circITGA7可與miRNA-370-3p結合，拮抗miRNA-370-3p對神經纖維蛋白1的抑制，通過阻斷Ras信號通路和促進整合素α7（integrin subunit alpha 7，ITGA7）基因的轉錄從而抑制結直腸癌細胞的增殖和轉移。circRNA不僅與結直腸癌的進展關系密切，還可用于評估患者對化療藥物的耐藥性。Abu等[24]通過對化療耐藥和化療敏感的結直腸癌細胞進行circRNA測序及對差異表達譜進行分析發(fā)現，共有773個circRNA的表達上調，732個circRNA的表達下調，其中，差異表達的hsa_circ_32883可能是化療敏感的生物學標志物。

3.4 神經膠質瘤

Renjie等[25]研究發(fā)現，circNT5E通過直接結合miRNA-422A并抑制其活性，降低NT5e、sox4、磷酯酰肌醇-3激酶催化亞單位α（phosphatidylinositol-3 kinase catalytic subunit alpha，PI3KCA）、磷酸化蛋白激酶 B（phosphorylation protein kinase B，p-AKT）和磷酸化 Smad2（phosphorylated Smad2，P-Smad2）的表達水平，從而影響神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。Zhang等[26]通過核糖體新生鏈復合物結合RNA測序（RNC-seq）發(fā)現了幾種可能由環(huán)RNA編碼的肽，并進一步鑒定出由基因間長鏈非蛋白編碼RNA p53誘導的轉錄物（long intergenic non-protein-coding RNA p53-induced transcript，LINC-PINT）編碼的87-氨基酸肽，直接與聚合酶相關因子復合物（polymerase associated factor complex，PAF1C）相互作用，抑制多種腫瘤基因的轉錄；與正常組織相比，膠質母細胞瘤組織中的87-氨基酸肽和circRNA的表達水平較低，這為circRNA編碼蛋白及其在神經膠質瘤中的潛在作用提供了新的證據。circ-SHPRH在內部核糖體進入位點（internal ribosome entry site，IRES）元件的驅動下產生一種新的腫瘤抑制蛋白SHPRH-146aa，SHPRH-146aa與全長蛋白協(xié)同發(fā)揮作用，保護誘導分子免于被降解，從而發(fā)揮腫瘤抑制劑的作用。Begum等[27]研究表明SHPRH-146aa高表達膠質母細胞瘤患者的生存期較長。

3.5 前列腺癌

有研究通過對前列腺癌（prostate cancer，PCA）組織和癌旁組織中的circRNA進行測序，篩選了1021個異常表達的circRNA，證實了PCA中circRNA的異常表達[28]。Chen等[29]對144例PCA組織進行全RNA基因組測序，篩選出了7232個與腫瘤相關的circRNA，其中，circCSNK1G3與miRNA-181結合可促進腫瘤細胞的生長；circRNA可調節(jié)其親本基因的轉錄水平，90%的circRNA在腫瘤的增殖過程中發(fā)揮著重要的作用，而其線性對應產物卻無此種作用，表明circRNA在轉錄過程中獨立發(fā)揮作用。Yang等[30]研究發(fā)現，Amotl1基因衍生的circRNA circAMOTL1L在人類PCA中的表達水平較低，而下調的circAMOTL1L通過下調E-鈣黏蛋白的表達和上調波形蛋白的表達從而促進PCA細胞的遷移和侵襲，導致上皮-間充質轉化和PCA進展。此外，該研究還發(fā)現RBM25基因可直接與circAMOTL1L結合并誘導其發(fā)生生物作用，而p53通過直接激活RBM25基因對上皮-間充質轉化過程進行調節(jié)。這些研究證實，p53/RBM25介導的circAMOTL1L-miRNA-193a-5p-Pcdha調控軸與PCA細胞的上皮-間充質轉化過程有密切關系。

3.6 肝癌

Qiu等[31]通過繪制肝癌組織和癌旁組織circRNA表達譜，發(fā)現有38個circRNA的表達下調，4個circRNA的表達上調，其中，circADAMTS13表達上調與腫瘤大小呈負相關，與患者的預后呈正相關，可作為肝細胞癌預后的評價指標。Wei等[32]通過對mRNA、circRNA、miRNA進行全基因組測序發(fā)現，circ-CDYL在早期肝細胞癌組織中的表達水平明顯升高，可作為miRNA-892a和miRNA-328-3p的海綿，與編碼肝癌衍生生長因子（hepatomaderived growth factor，HDGF）和缺氧誘導因子天冬酰胺羥化酶（hif1an）的mRNA相互作用，激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，也稱AKT）-雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，MTORC1）/β-catenin 和Notch2通路，促進原癌基因含重復凋亡結構桿狀病毒抑制劑5（baculoviral inhibitor of apoptosis protein repeat containing 5，BIRC5）、survivin和myc效應蛋白桿狀病毒凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）重復序列的表達，這揭示了肝細胞癌早期以circRNA為中心的非編碼調控RNAS網絡和早期肝癌鑒別腫瘤標志物。除了circRNA-miRNA-mRNA軸在肝細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用得到了初步證實外，circRNA與mRNA結合蛋白協(xié)同調控肝細胞癌發(fā)生發(fā)展的機制也逐漸受到學者們的重視。Liang等[33]的研究證實了circβ-catenin（circ-0004194）可通過拮抗糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）誘導的β-連環(huán)蛋白磷酸化和降解從而穩(wěn)固全長β-連環(huán)蛋白表型，激活WNT信號通路，調節(jié)肝癌細胞的生長。

3.7 胃癌

circPVT1在胃癌組織中高表達，可作為miRNA-125家族的海綿從而促進腫瘤細胞的增殖。Chen等[34]研究表明，circPVT1可作為胃癌患者總生存情況和無瘤生存情況的獨立預測指標。Ding等[35]研究發(fā)現circ-DONSON在胃癌組織中高表達，通過激發(fā)NURF復合物啟動SOX4從而調控轉錄，且其高表達與腫瘤的進展和不良預后呈正相關。Huang等[36]發(fā)現，來源于AKT3基因外顯子8、9、10和11的circAKT3（hsa_circ_0000199）在順鉑耐藥的胃癌細胞和組織中高表達，circAKT3作為miRNA-198的海綿可以上調PIK3R1的表達，增加對順鉑的耐藥性。

3.8 骨肉瘤

有研究表明，Hsa_circ_0081001可作為骨肉瘤診斷和預后預測的生物標志物，可動態(tài)監(jiān)測和反映骨肉瘤患者的病情[37]。circTADA2A在骨肉瘤組織和細胞中呈高表達，并可作為miRNA-203a-3p的海綿上調腫瘤啟動子CREB3，從而調控骨肉瘤的發(fā)生和轉移[38]。

3.9 多腫瘤的研究

有部分研究同時納入了幾種腫瘤進行觀察。Zheng等[39]通過對6例正常組織標本（腦、肺、胃、肝、心臟和結腸）和7例腫瘤組織標本（膀胱癌、腎癌、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌）進行RNA測序，檢測出27 000多個circRNA，證實在正常組織和腫瘤組織中，不同circRNA的表達情況是不同的。circHIPK3是來源于HIPK3基因外顯子2的一類circRNA，通過沉默circHIPK3能夠明顯抑制人類細胞的生長；該研究通過熒光素酶篩選分析發(fā)現，circHIPK3對9個miRNA具有海綿作用，且有18個潛在的結合位點，其中circHIPK3可與miRNA-124直接結合并抑制其活性。Chen等[40]發(fā)現，circAGO2在胃癌、結腸癌、前列腺癌和神經母細胞瘤中的表達上調，且與人抗原R蛋白相互作用，從而減少其與親本基因AGO2的結合，抑制AGO2/miRNA介導的基因沉默功能，從而促進腫瘤細胞在體內外的生長、侵襲和轉移。

4 小結與展望

近年來，腫瘤的發(fā)病率逐漸升高，腫瘤的早期篩查和靶向治療已成為目前腫瘤領域的研究熱點。circRNA起初被認為是RNA中拼接錯誤的產物，是無功能的，而進一步的深入研究使人們改變了對circRNA的認知。盡管對circRNA的研究處于起步階段，但已代替miRNA、lncRNA成為非編碼RNA研究中的一個新方向。由于circRNA具有閉環(huán)結構使其可穩(wěn)定存在于細胞質中不被降解，其疾病特異性使其可作為腫瘤早期篩查和預后評價的標志物，對于闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體機制、作為新的有效靶點具有重要意義。目前關于circRNA-miRNA-mRNA軸的研究較多，也有少量關于circRNA與RNA結合蛋白通路的研究，然而對circRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的具體生物學功能及其機制尚未明確，但隨著目前高通量測序技術的逐步完善和測序價格的降低，使更多的研究者將投入大量的人力、物力、財力研究更多關于腫瘤的測序數據以及非編碼RNA的網絡作用關系，為腫瘤基因治療提供新的方向。