張鵬飛 邊帥 趙月 趙雨 王佳雯

（長春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省人參科學(xué)研究院，長春 130117）

人參（Panax ginsengC. A. Mey）是東北重要的藥用植物，具有抗氧化、抗衰老、增強機體免疫能力、治療心血管、糖尿病及腦部疾病等多種藥理作用［1-6］。然而人參的生長周期過長，在其生長過程中受到多種病害的侵擾［7-8］，目前主要方法是噴灑農(nóng)藥，但易使病原體產(chǎn)生耐藥性并帶來農(nóng)藥殘留。研究抗菌肽［9］類的生物農(nóng)藥是解決這些問題的辦法之一，能夠提高人參的產(chǎn)量，帶來良好的經(jīng)濟效益。近年來多種植物抗菌肽被發(fā)現(xiàn)并研究。硫堇蛋白是一種廣泛存在于植物細胞，具有廣譜抑菌效果的小分子多肽。目前人參硫堇蛋白的抗菌效果尚未報道。前期通過人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，進行人參發(fā)病情況及抗菌肽表達量的相關(guān)性分析，篩選發(fā)現(xiàn)人參硫堇蛋白的表達與人參病害有著密切的關(guān)系。本研究擬通過構(gòu)建人參硫堇蛋白的原核表達質(zhì)粒，在大腸桿菌中進行蛋白表達并純化，驗證人參硫堇蛋白的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體pGEX-4T1、E.coliDH5α菌株、E.coliBL21由長春中醫(yī)藥大學(xué)生物工程實驗室保存，黑斑菌菌株由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院提供。限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒等購自TaKaRa公司；鎳離子親和層析預(yù)裝柱和Amicon Ultra-15 10K超濾管購自GE公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純或進口分裝試劑。硫堇蛋白成熟肽基因由長春華大中天生物技術(shù)有限公司合成并連入亞克隆載體中。

1.2 方法

1.2.1 原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 將合成的pMD-18T-thionins質(zhì)粒和原核表達載體pGEX-4T1分別進行BamHⅠ和NotⅠ雙酶切，回收。用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，接種氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆進行酶切鑒定。

1.2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達的優(yōu)化 將鑒定正確的pGEX-4T1-thionins質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，接種氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆至試管，過夜培養(yǎng)，按照1∶100的比例接種到LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，共9份，編號為1-9。1號為不加IPTG的空白對照；2-9號分別加入終濃度為0.1、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5和2.0 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)。并分別在誘導(dǎo)3、5和8 h時取1 mL菌液進行SDS-PAGE。比較在不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時間目的蛋白的表達情況，篩選出最佳誘導(dǎo)條件。

1.2.3 SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色 取1 mL菌液于EP管中，10 000 r/min離心1 min，去上清，沉淀使用100 μL ddH2O重懸，取20 μL重懸液加入20 μL電泳上樣緩沖液并煮沸10 min致蛋白變性，使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進行樣品分離。用考馬斯亮藍染色液37℃染色15 min。用脫色液將其脫色至可見清晰條帶，使用凝膠成像儀進行分析。

1.2.4 蛋白純化 將誘導(dǎo)后離心收集的菌體沉淀，經(jīng)PBS洗滌2次，細胞裂解液裂解菌體，加入PMFS和溶菌酶，冰上攪拌20 min，加入脫氧膽酸鈉37℃攪拌10 min，冰上超聲破碎30 min，最后加入核酸酶，37℃反應(yīng)30 min，其間不斷震蕩至液體不再黏稠。液體10 000 r/min離心20 min，收集包涵體沉淀。使用包涵體洗滌液洗滌沉淀，包涵體溶解液（含1.5%十二烷基肌氨酸鈉）溶解沉淀，0.22 μm濾膜過濾，使用1 mL Ni-NTA柱純化，結(jié)合液（含10 mmol/L咪唑）洗滌去除雜蛋白，使用50 mmol/L咪唑緩沖液將目的蛋白從柱上洗脫，收集洗脫液。將純化后的蛋白溶液放入透析袋中梯度透析，透析液為分別含有0.8%、0.6%、0.3%和0.1%十二烷基肌氨酸鈉（SKL）的磷酸鹽緩沖液，0.1×PBS透析36 h。最后使用超濾管濃縮蛋白。

1.2.5 免疫印跡法 SDS-PAGE后，使用半干轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。置于5%的脫脂牛奶室溫封閉30 min；PBST漂洗后一抗4℃孵育過夜；PBST漂洗3次，加入二抗室溫孵育45 min；PBST漂洗3次，加入顯色底物，至特異性條帶清晰可見時，終止反應(yīng)。

1.2.6 紙片擴散法 將新華1號定性濾紙剪成6 mm直徑的圓形小紙片并滅菌。將黑斑菌菌塊接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)，待菌絲生長到一定程度，將紙片均勻的貼在培養(yǎng)基上，保證各濾紙片距離中心的距離一致。向濾紙片滴加人參硫堇蛋白溶液，空白加入GST蛋白溶液。放入28℃恒溫箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，定期觀察抑菌情況。生長抑制率（%）=1-（GST組真菌生長半徑r0（cm）-硫堇蛋白組真菌生長半徑r?。╟m））/GST組真菌生長半徑r0（cm）×100%。

1.2.7 半數(shù)抑制濃度（IC50）試驗 將菌塊接種到液體土豆培養(yǎng)基（PDB）中，28℃、160 r/min震蕩培養(yǎng)3 d。然后用8層紗布過濾，利用血球計數(shù)板進行孢子計數(shù)，用培養(yǎng)基將孢子稀釋到約3×104孢子數(shù)/mL，96微孔板每孔加入90 μL孢子稀釋液以及10 μL不同濃度的人參硫堇蛋白溶液，混勻，28℃暗培養(yǎng)，36 h時使用酶標儀在595 nm波長下，記錄各孔吸光度值，計算抑菌率，得出半數(shù)抑制濃度。計算公式抑菌率（%）=（空白組OD值-實驗組OD值）/空白組OD值×100。

1.2.8 質(zhì)膜通透性試驗 96微孔板每孔加入100 μL孢子稀釋液（濃度同上），同時加入終濃度為14 μmol/L的人參硫堇蛋白和25 μmol/L SYTOX綠色熒光染料，并設(shè)無蛋白的空白組，在25℃孵育30 min。用熒光顯微鏡觀察對質(zhì)膜的透化作用。

2 結(jié)果

2.1 人參thionins的序列分析

從NCBI中獲得人參thionins序列，長度228 bp，編碼75個氨基酸，預(yù)測分子量為5.16 kD，預(yù)測等電點為9.3，二級結(jié)構(gòu)包括29.33% α-螺旋、12%延伸鏈、8% β-轉(zhuǎn)角和50.67%無規(guī)卷曲。根據(jù)Signalp-4.1Signalp analysis軟件分析，人參thinoins蛋白的1-28位氨基酸為前導(dǎo)肽序列（圖1下劃線處）。選取其成熟肽區(qū)域（29-75 aa）進行后續(xù)的表達和純化。

圖1 人參硫堇蛋白的結(jié)構(gòu)分析

2.2 人參thionins原核表達載體的構(gòu)建和鑒定

對人參thinoins的成熟肽部分基因進行人工合成，為了后續(xù)純化在C末端加入6×His標簽。將目的片段連入原核表達載體pGEX-4T1中。進行瓊脂糖凝膠電泳分析。質(zhì)粒線性大小約為5 000 bp，但由于質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu)，在電泳結(jié)果呈現(xiàn)出2 000-3 000 bp大小的條帶。經(jīng)雙酶切鑒定，在5 000 bp和100-250 bp兩處可見特異性條帶，分別為pGEX-4T1線性片段及thinoins片段（圖2），證明pGEX-4T1-thinoins構(gòu)建成功。

圖2 原核表達載體pGEX-4T1-thinoins的雙酶切鑒定

2.3 人參硫堇蛋白的誘導(dǎo)表達

通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件，獲得最佳誘導(dǎo)方法：菌種過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接于20 mL培養(yǎng)基中，37℃200 r/min震蕩培養(yǎng)，待OD600值達到0.6-0.8，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，5 h后終止誘導(dǎo)。經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍檢測分析，結(jié)果（圖3）顯示，在約33 kD處有一特異表達的蛋白帶，與預(yù)期的人參GST-thinoins-His融合蛋白的大小基本一致，表明成功誘導(dǎo)了融合蛋白。

圖3 人參硫堇蛋白表達形式檢測結(jié)果

2.4 人參硫堇蛋白的純化和除鹽

誘導(dǎo)后裂解菌體，分別取上清和沉淀進行SDSPAGE檢測蛋白表達形式，特異性條帶出現(xiàn)在沉淀中，說明重組蛋白以包涵體的形式存在（圖3）。溶解包涵體后，使用HisTrap FF柱進行分離純化。當洗脫液中咪唑濃度為50 mmol/L時，目的蛋白被充分洗脫（圖4）。洗脫液放入透析袋中梯度透析除鹽。由于純化后蛋白在25 kD處有另一條帶，對純化蛋白進行免疫印跡分析，結(jié)果與考馬斯亮藍結(jié)果類似，anti-GST抗體和anti-His抗體在33 kD和25 kD處均能檢測得到目的蛋白（圖4），說明25 kD處的條帶可能是重組蛋白的不同剪切形式。

圖4 人參硫堇蛋白純化及檢測結(jié)果

2.5 人參硫堇蛋白的抗真菌活性

通過對人參進行土傳真菌黑斑菌的體外抑菌實驗，結(jié)果（圖5）表明，人參硫堇蛋白在3和9 μmol/L濃度時對黑斑病菌絲的生長具有明顯的抑制作用（形成抑菌圈）。根據(jù)公式計算生長抑制率分別為36.0%和51.1%。使用黑斑孢子來檢測重組蛋白的半數(shù)抑制濃度，結(jié)果如表1所示，利用不同蛋白濃度的抑菌率來繪制趨勢線，利用公式計算得出重組蛋白對黑斑孢子的半數(shù)抑制濃度為0.87 μmol/L。質(zhì)膜通透性試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)硫堇蛋白處理過的黑斑孢子，SYTOX熒光染料可進入孢子內(nèi)與DNA結(jié)合，發(fā)出綠色熒光，而空白組在顯微鏡下則沒有熒光（圖6）。說明人參硫堇蛋白可以誘導(dǎo)黑斑孢子質(zhì)膜通透性發(fā)生改變進而達到抑菌效果。

趨勢線公式y(tǒng)=47.69x+8.51

圖5 人參硫堇蛋白抑制黑斑病菌生長

表1 不同蛋白濃度的抑菌率

圖6 人參硫堇蛋白改變黑斑病菌孢子細胞膜通透性

3 討論

植物在生長過程中不可避免地受到多種病原微生物的影響，在長期的進化過程中，植物形成了獨特的防御機制來抑制病原微生物的侵染和傳播。其中，大量表達抗菌肽是一種重要的防衛(wèi)機制。抗病毒蛋白和多肽包括幾丁質(zhì)酶、防御素和類防御素蛋白、親環(huán)素蛋白、葡聚糖酶、過敏多肽、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、硫堇蛋白和過氧化物酶等［10-14］。其中，硫堇蛋白已經(jīng)在至少15種植物中被分離出來并鑒定［15-17］。

本研究使用分子生物學(xué)手段成功構(gòu)建了人參硫堇蛋白成熟肽的原核表達質(zhì)粒，選擇這一部分蛋白來單獨表達是由于通過軟件分析蛋白N端具有一個前導(dǎo)肽，表達后引導(dǎo)蛋白定位在細胞壁上，之后前導(dǎo)肽被剪切下來。因此發(fā)揮作用的硫堇蛋白應(yīng)該是切除了前導(dǎo)肽的成熟肽部分。本研究采用原核表達載體pGEX-4T1，該載體上帶有GST融合蛋白，能夠增加重組蛋白的可溶性和表達量［18］，同時，由于多數(shù)物種的硫堇蛋白具有抑菌活性，為了防止人參硫堇蛋白在大腸桿菌中表達造成毒性產(chǎn)生菌體自溶，加入融合蛋白可以中和這一毒性［19］。在本研究中，GST沒能增加重組蛋白的可溶性，但是中和了硫堇蛋白的毒性，重組蛋白以包涵體形式成功表達。另外，在C端加入6×His標簽，便于包涵體蛋白變性后親和純化。硫堇蛋白的成熟肽部分具有多個半胱氨酸，其是否能夠形成二硫鍵是未知的，而通過變性后復(fù)性的純化方法能否破壞二硫鍵進而影響蛋白功能也是需要研究的一個部分。未來可以通過人工合成該多肽，然后分析活性、高分辨質(zhì)譜精確分子量并進行肽指紋圖譜分析，進一步了解其構(gòu)象和功能。

本研究發(fā)現(xiàn)，多種抗菌肽的抗菌機制為在靶細胞膜上形成離子通道，使細胞膜兩側(cè)的膜電位發(fā)生改變，靶細胞因滲透壓改變，水溶性物質(zhì)滲出而死亡［20］。本研究純化的重組硫堇蛋白能夠特異性的抑制黑斑病真菌的生長，且機制為改變真菌細胞膜的通透性，符合大部分抗菌肽的抗菌機制。

4 結(jié)論

成功克隆了人參thionins，thionins蛋白體外具有活性，能抑制黑斑病菌的生長。