吳晉強(qiáng) ，曹 靖 ，程笳琪 ，閆瑞琴 ，陸 娜 ，張嬌嬌 ，吳佳豪 ，張鵬翔 ，赫曉燕

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，北京102442）

毛囊是動(dòng)物最復(fù)雜的微型器官之一，具有重建自身的能力[1-4]。毛胚細(xì)胞（Hair germs cell）被確認(rèn)是早期的毛囊前體細(xì)胞。當(dāng)表皮基底層細(xì)胞下陷進(jìn)入被聚集的間充質(zhì)細(xì)胞包圍的真皮中時(shí)，形成毛胚細(xì)胞；毛胚細(xì)胞繼續(xù)伸長(zhǎng)之后被稱為毛腳或毛釘。被相關(guān)間充質(zhì)細(xì)胞包圍的毛釘變平的末端，形成一個(gè)球根狀凹面的結(jié)構(gòu)[5]，形成凹狀面的上皮細(xì)胞變成基體，并產(chǎn)生內(nèi)根鞘和纖維。毛囊兩側(cè)的剩余間充質(zhì)細(xì)胞變成外根鞘，在毛囊的中部區(qū)域細(xì)胞組織形成皮脂腺的原基和隆起部分[6]。有研究表明，小鼠胚胎第13天是毛囊形成前期，毛胚細(xì)胞沒有明顯向下凹陷；胚胎第14天毛囊形成開始，毛胚細(xì)胞向下凹陷；胚胎第15天毛胚細(xì)胞繼續(xù)向下凹陷形成毛釘；胚胎第16天時(shí)向下凹陷形成球根狀毛釘；胚胎第17天時(shí)毛囊初步形成[1-2]。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）家族可分為7個(gè)亞家族，其中，F(xiàn)GF7亞家族成員包括 FGF7，F(xiàn)GF10，F(xiàn)GF22[7-8]。FGF7 又稱為角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte growth factor1 KGF1）[9]，其是上皮細(xì)胞的特異性促分裂原，對(duì)上皮細(xì)胞旁分泌介質(zhì)起到增殖的作用[10]；FGF10是一個(gè)典型的旁分泌型FGF[11]，其以旁分泌的方式介導(dǎo)間充質(zhì)與上皮信號(hào)傳導(dǎo)，在腺體、被毛、牙齒等器官中發(fā)揮重要的作用[12]；FGF22與FGF7和FGF10不同，F(xiàn)GF22蛋白質(zhì)缺乏大多數(shù)分泌型FGF應(yīng)有的特征，即N-糖基化的共有序列，因此，F(xiàn)GF22的表達(dá)相對(duì)受限[13-14]。

FGF7亞家族在毛囊發(fā)育領(lǐng)域的作用受到越來越多的關(guān)注。然而，有關(guān)FGF7亞家族對(duì)小鼠胚胎毛囊形成作用的研究未見報(bào)道。

本試驗(yàn)將選取 13～17 d（E13d～E17d）的胚胎期小鼠作為試驗(yàn)材料，利用免疫組織化學(xué)和Western blot方法研究FGF7亞家族成員在胚胎期小鼠毛囊形成過程中的表達(dá)，旨在了解FGF7亞家族在小鼠胚胎毛囊形成過程中的作用，為進(jìn)一步揭示胚胎期小鼠毛囊的形成及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

兔Streptavidin-HRP試劑盒（康為）；兔抗FGF7多克隆抗體（美國(guó)Thermo）；兔抗FGF10多克隆抗體（美國(guó) Santa Cruz Biotechnology）；兔抗 FGF22多克隆抗體（美國(guó)Novus Biologicals）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及取材

50只ICR小鼠購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)（40只小鼠為雌性小鼠，10只小鼠為雄性小鼠）。晚上將雄鼠和雌鼠按1∶4的比例合籠，第2天早查看母鼠陰道栓進(jìn)行分籠，并標(biāo)記為懷孕第1天。13～17 d每天取1只孕鼠，處死后取3個(gè)完整的胚胎放入Bouin氏固定液中固定24 h后，常規(guī)制片，片厚6 μm，用于免疫組織化學(xué)分析[15]。另外3只胚胎取其背部皮膚快速放入液氮中，用于提取總蛋白。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué) 根據(jù)兔Streptavidin-HRP試劑盒說明書，在組織切片上滴加試劑盒中的試劑。將組織切片的一側(cè)與以下抗體一起孵育：1∶60稀釋的兔抗FGF7多克隆抗體；1∶45稀釋的兔抗FGF10多克隆抗體；1∶50稀釋的兔抗FGF22多克隆抗體。將組織切片的另一側(cè)在PBS中于4℃溫育14 h，在室溫下儲(chǔ)存30 min后，將組織切片在振蕩器上洗滌3次，每次3 min。將組織切片用山羊抗兔二抗溶液在室溫下孵育10 min。洗滌后，將組織切片孵育DAB色溶液，隨時(shí)觀察顯色狀況，直至獲得最佳結(jié)果。用LEICA DMLB2的Leica光學(xué)顯微鏡采集圖像。

1.3.2 Western blot檢測(cè) 取液氮罐中保存的小鼠皮膚組織，按總蛋白提取試劑盒（碧云天）提供的操作步驟提取小鼠皮膚的總蛋白，使用ND-1000微量核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度。每個(gè)樣品的總蛋白量為400 μg，在15%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，電泳完畢后轉(zhuǎn)移至NC膜；將NC膜放入5%的脫脂蛋白干粉對(duì)其進(jìn)行封閉1 h，4℃孵育一抗過夜（FGF7兔抗多克隆抗體1∶800；FGF10兔抗多克隆抗體1∶500；FGF22兔抗多克隆抗體1∶700）。次日復(fù)溫30 min后，用TBST洗膜，共洗3次，每次10 min。加入經(jīng)TBST溶液稀釋的二抗（1∶12 000，HRP-山羊抗兔IgG，康為世紀(jì)公司），37℃孵育90 min。用TBST洗膜，共洗4次，每次5 min。運(yùn)用ECL試劑盒在暗室中進(jìn)行曝光之后，對(duì)其信號(hào)條帶進(jìn)行掃描。利用 Image J分析 FGF7，F(xiàn)GF10和FGF22蛋白和β-actin蛋白條帶灰度值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

免疫組化光密度值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，Western blot統(tǒng)計(jì)結(jié)果利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 FGF7免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，在E13d，F(xiàn)GF7蛋白表達(dá)相對(duì)較弱；在E14d～E16d，F(xiàn)GF7主要在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中觀察到；在E17d，F(xiàn)GF7主要在表皮細(xì)胞中表達(dá)，并且在球根狀毛釘中幾乎沒有觀察到陽性FGF7信號(hào)（圖1）。光密度數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（表 1），F(xiàn)GF7 蛋白在 E14d，E15d，E16d 和 E17d的表達(dá)量分別是E13d的1.712倍（P＜0.001），1.670 倍（P＜0.001），1.376 倍（P＜0.001），1.280 倍（P＜0.001，圖 2-A）。

2.1.2 FGF10免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF10蛋白主要在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中觀察到。FGF10蛋白在E15d陽性反應(yīng)最強(qiáng)；在E14d和E16d，主要在表皮細(xì)胞中觀察到FGF10。隨著時(shí)間的推移，F(xiàn)GF10陽性信號(hào)逐漸減弱（圖3）。光密度數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（表1），F(xiàn)GF10 蛋白在 E14d，E15d，E16d 和 E17d 的表達(dá)量分別是E13d的1.461倍（P＜0.001），1.917倍（P＜0.001），1.545 倍 （P＜0.001），1.129 倍 （P＜0.001，圖 2-B）。

表1 FGF7/10/22蛋白在小鼠皮膚中陽性反應(yīng)物的平均光密度

2.1.3 FGF22免疫組織化學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF22蛋白在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中均有廣泛表達(dá)（圖4）。光密度數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示（表1），F(xiàn)GF22蛋白在E13d，E15d，E16d和E17d的表達(dá)量分別是E14d的1.031倍（P＜0.05），1.136 倍 （P＜0.001），2.086 倍 （P＜0.001），2.324 倍（P＜0.001，圖 2-C）。

2.2 Western blot試驗(yàn)結(jié)果

Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7，F(xiàn)GF10 和FGF22在不同日齡小鼠的背部皮膚中均有表達(dá)，相對(duì)分子量大小分別為28，23，21 ku。Image J軟件的分析結(jié)果表明，F(xiàn)GF7在E14d表達(dá)量最高，在E17d表達(dá)量最低（圖5-A）；FGF7蛋白在E13d，E14d，E15d和E16d的表達(dá)量分別是E17d的1.14倍（P＜0.001），1.20 倍（P＜0.001），1.17 倍（P＜0.001），1.06倍（P＜0.01，圖 5-B）。FGF10在 E15d表達(dá)量最高，在E13d表達(dá)量最低（圖5-A）；FGF10蛋白在E14d，E15d，E16d和 E17d的表達(dá)量分別是 E13d 的3.11 倍（P＜0.001），3.57 倍（P＜0.001），3.04 倍（P＜0.001），2.65倍（P＜0.001，圖 5-C）。FGF22 在 E17d表達(dá)量最高，在E14d表達(dá)量最低（圖5-A）；FGF22蛋白在E13d，E15d，E16d和E17d的表達(dá)量分別是E14d的 1.04倍（P＞0.05），1.55倍（P＜0.001），1.72倍（P＜0.001）和 1.79 倍（P＜0.001，圖 5-D）。

3 討論

毛囊是一種通過組織生長(zhǎng)和重塑循環(huán)產(chǎn)生毛發(fā)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，由表皮和真皮2個(gè)部分組成[16]，最初是由包圍真皮下面一小簇細(xì)胞的表面外胚層向下生長(zhǎng)而形成。毛囊的形成分為感應(yīng)誘導(dǎo)、器官發(fā)生、細(xì)胞分化3個(gè)過程，可細(xì)分為8個(gè)階段。

FGF7由皮膚中的間充質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞/纖維細(xì)胞）合成和分泌，并由163個(gè)氨基酸編碼的糖蛋白組成。同時(shí)，F(xiàn)GF7充當(dāng)上皮細(xì)胞增殖的旁分泌介質(zhì)，刺激上皮細(xì)胞的遷移、擴(kuò)散和增殖[17-18]。免疫組織化學(xué)和Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF7在E14d的表達(dá)量最高。結(jié)果表明，F(xiàn)GF7在小鼠胚胎期第14天起主要作用。在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中檢測(cè)到FGF7的表達(dá)。毛囊在胚胎階段的第14天開始形成，此時(shí)毛胚的表皮增厚由基底層中的柵欄狀樣的角質(zhì)形成細(xì)胞組成。表皮基底層的角質(zhì)形成細(xì)胞稱為毛胚細(xì)胞。毛囊形成的特征是真皮成纖維細(xì)胞數(shù)量的局部增加，臨近于毛胚沉積的表皮增厚[1-2]。研究表明，F(xiàn)GF7在毛囊形成中起重要作用。SCHMID等[19]研究表明，F(xiàn)GF7是一種真皮乳頭信號(hào)，參與指導(dǎo)毛胚細(xì)胞增殖。此外，PETIOT等[20]研究也證明，在小鼠模型試驗(yàn)中，敲除FGF7的受體FGFR2 IIIb導(dǎo)致小鼠的毛囊密度降低和毛囊發(fā)育遲緩。結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)GF7在毛囊形成中有重要作用，在毛囊形成的啟動(dòng)階段，可能參與指導(dǎo)毛胚細(xì)胞的增殖。

FGF10也稱為角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子2，其以旁分泌形式介導(dǎo)間充質(zhì)和上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在多個(gè)器官中起重要作用[21]。免疫組織化學(xué)和Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF10在E15d的表達(dá)量最高。結(jié)果表明，F(xiàn)GF10在毛囊發(fā)育的第15天起主要作用，在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中檢測(cè)到FGF10的表達(dá)。毛胚細(xì)胞下陷到真皮中，在E15d和E16d形成毛釘和球根狀毛釘，毛胚突起增多，表皮角質(zhì)形成細(xì)胞變長(zhǎng)變寬。毛胚細(xì)胞呈現(xiàn)出前后極向（毛胚近端朝向頭部，遠(yuǎn)端朝向尾部）[1-2]。研究表明，F(xiàn)GF10在毛釘和球根狀毛發(fā)釘?shù)男纬芍衅鹬匾饔?。在已知的FGF家族成員中，F(xiàn)GF10與FGF7具有功能相似性[22]，其中，F(xiàn)GF10在毛囊形成中有重要作用，在毛囊形成的關(guān)鍵階段，可能參與指導(dǎo)毛釘和球根狀毛發(fā)釘?shù)男纬伞?/p>

FGF22是FGF7亞家族的另一成員，其與FGF7和FGF10密切相關(guān)。免疫組織化學(xué)和Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GF22在E17d的表達(dá)量最高。結(jié)果表明，F(xiàn)GF22在毛囊發(fā)育的第17天起主要作用，在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中檢測(cè)到FGF22表達(dá)；在第17天時(shí)毛囊初步形成，毛釘已經(jīng)變得高度伸長(zhǎng)并且顯示出早期毛囊的第一特征：在毛釘尾部的細(xì)胞呈現(xiàn)燈泡狀增厚，形成一個(gè)突出的寬的真皮乳頭腔；此時(shí)，內(nèi)根鞘的上皮層或Henle層在真皮乳頭上方形成錐形結(jié)構(gòu)[1-2]。研究表明，F(xiàn)GF22在毛釘成熟中起重要作用。具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）結(jié)合位點(diǎn)和CCAAT盒的FGF7啟動(dòng)子和具有雙bHLH結(jié)合位點(diǎn)的FGF10啟動(dòng)子較為保守，而FGF22啟動(dòng)子則不同[14]。結(jié)果顯示，F(xiàn)GF22在毛囊中的功能不同于FGF7和FGF10。推測(cè)FGF22在毛囊形成和成熟中起重要作用，在毛囊基本形成階段，可能促進(jìn)毛釘成熟。

4 結(jié)論

本研究表明，在胚胎期小鼠皮膚組織中，F(xiàn)GF7（FGF7/FGF10/FGF22）亞家族主要在毛胚細(xì)胞、毛釘、球根狀毛釘、表皮和真皮細(xì)胞中表達(dá)。FGF7亞家族3個(gè)成員在胚胎小鼠毛囊形成中均可發(fā)揮重要作用，其中，F(xiàn)GF7在毛囊形成的啟動(dòng)階段即胚胎期第14天發(fā)揮主要作用，可能參與指導(dǎo)毛胚細(xì)胞的增殖；FGF10在毛囊形成的關(guān)鍵階段即胚胎期第15天發(fā)揮主要作用，可能參與指導(dǎo)毛釘和球根狀毛發(fā)釘?shù)男纬桑籉GF22在毛囊的基本形成階段即胚胎期第17天發(fā)揮主要作用，可能促進(jìn)毛釘成熟。