楊瑞瑞，王 蘭，孫 敏，申 萍

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

鎘是環(huán)境中具有極強(qiáng)毒性的重金屬污染物之一。工農(nóng)業(yè)廢棄物和生活污水的排放，使環(huán)境中的鎘污染日益嚴(yán)重。鎘可通過呼吸、吸附和攝入累積于生物體內(nèi)，從而對生物體產(chǎn)生毒性[1]。少量鎘長期積累于生物體內(nèi)會對呼吸道產(chǎn)生刺激，對肝、腎、生殖等造成損傷，而且對胚胎的發(fā)育產(chǎn)生各種不利影響[2-3]。鎘誘導(dǎo)生物體自由基和活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量生成，造成氧化損傷。大量研究顯示，鎘的毒性機(jī)制與機(jī)體受氧化脅迫有關(guān)[4-5]。QU等[6]和JANCSó等[7]研究表明，鎘暴露后會導(dǎo)致鯽魚（Carassius auratus）和鯉魚（Cyprinus carpio）的肝臟等組織中MDA含量和SOD，CAT，GPx等抗氧化酶活性發(fā)生改變。WANG等[8]將濃度為64.5，129，258，516，1 032 μmol/L 的鎘暴露于河南華溪蟹（Sinopotamon henanense）7 d后檢測鎘對精巢的毒性作用發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度增加，SOD活性先升高后降低；MDA和H2O2含量隨鎘濃度的升高而增加。HO等[9]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為2.5 μmol/L的鎘暴露于斑馬魚胚胎10 hpf后，能夠顯著下調(diào)Cu/Zn-SOD基因的表達(dá)。JIN等[10]研究表明，鎘脅迫斑馬魚胚胎96 hpf后會導(dǎo)致其運動行為發(fā)生顯著改變，同時，MDA含量增加，SOD等抗氧化酶活性改變。此外，急性鎘暴露會使得斑馬魚幼魚MDA含量顯著增加，GPx活性顯著下降，造成氧化損傷[11]。

斑馬魚（Danio rerio）已被廣泛應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域，如藥物毒理學(xué)、生態(tài)毒理學(xué)及環(huán)境檢測[12]。1998年經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）將斑馬魚胚胎毒性試驗方法列為測定單一化學(xué)品毒性的標(biāo)準(zhǔn)方法之一[13]。目前，斑馬魚胚胎已被廣泛應(yīng)用于有機(jī)污染物的監(jiān)測。與斑馬魚成魚相比，斑馬魚早期胚胎具有發(fā)育快、易獲得、易觀察、敏感且透明等優(yōu)點。目前，鎘暴露對斑馬魚肝、腎、神經(jīng)系統(tǒng)的毒性效應(yīng)已有諸多報道，但鎘對斑馬魚早期胚胎的發(fā)育毒性機(jī)制還不清楚。

本試驗以斑馬魚早期胚胎為研究對象，探討鎘對早期胚胎的發(fā)育毒性，旨在為進(jìn)一步研究鎘對胚胎原始生殖細(xì)胞的毒性效應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試動物 試驗用斑馬魚品系為AB系，飼養(yǎng)于山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物學(xué)實驗室斑馬魚養(yǎng)殖水循環(huán)體系中，養(yǎng)殖系統(tǒng)循環(huán)水是用反滲透凈水機(jī)制備，水溫（28.3±1）℃，電導(dǎo)率為450～550 μS/cm，pH值為 7.0～7.5（利用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)），光周期為14 h光照/10 h黑暗，每天飼喂2次活豐年蝦。

1.1.2 主要儀器及試劑

1.1.2.1 主要儀器 恒溫光照培養(yǎng)箱（MGC-450BP，上海一恒科學(xué)儀器有限公司），體視顯微鏡（SZX16＋DP71＋I(xiàn)PP，日本），電動勻漿儀（F6/10，德國FLUKO公司），冷凍離心機(jī)（5804R，德國Eppendorf公司），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，美國 MD公司）。

1.1.2.2 主要試劑 氯化鎘，純度為99.0%，購于Sigma公司；丙二醛（MDA）檢測試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 鎘暴露試驗 收集胚胎的前1 d晚上，每個產(chǎn)卵缸放入雌魚與雄魚比例為1∶1或1∶2的斑馬魚成魚，雌雄魚用隔板分隔開，次日早晨待光照30 min后將隔板移去，于產(chǎn)卵后20 min左右收集受精卵。收集0.5 hpf內(nèi)健康的斑馬魚胚胎置于玻璃皿中，每皿100顆胚胎，80 mL系統(tǒng)循環(huán)水。結(jié)合《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—92）》和鎘對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的報道[14-15]，本研究設(shè)置 0，4.44，8.90，17.80，26.70，35.60 μmol/L6 個鎘濃度。胚胎進(jìn)行鎘暴露后，將其置于28.5℃光照培養(yǎng)箱中使胚胎繼續(xù)發(fā)育。

1.2.2 斑馬魚胚胎畸形表型觀察 胚胎經(jīng)鎘暴露后發(fā)育至 2，6，10，24 hpf時，每組隨機(jī)選取 20 顆胚胎，體視顯微鏡觀察胚胎發(fā)育情況，并記錄其死亡數(shù)和畸形數(shù)。以卵凝結(jié)作為死亡終點。

1.2.3 MDA含量測定 取鎘暴露后發(fā)育至2，6，10，24 hpf的斑馬魚胚胎，各處理組分別隨機(jī)選取15顆胚胎，稱質(zhì)量后置于冰上，按質(zhì)量體積比1∶19加入0.75%的生理鹽水，勻漿，將勻漿液于4℃離心機(jī)（2 500 r/min，10 min）離心，取上清液。

采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA含量，并根據(jù)試劑盒說明書依次加入試劑，漩渦混勻，水浴，4 ℃離心機(jī)（4 000 r/min ，10 min）離心，取 200 μL上清液，加入96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀測定OD值（激發(fā)波長532 nm）。

1.2.4 SOD活性測定 采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，按1.2.3的方法將胚胎勻漿后，根據(jù)試劑盒說明書操作，取200 μL上清液，加入96孔酶標(biāo)板中，酶標(biāo)儀測定OD值（激發(fā)波長550 nm）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上試驗均重復(fù)5～6次。所得數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，通過LSD進(jìn)行分析比較顯著性（P＜0.05，表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘暴露后斑馬魚早期胚胎死亡率分析

從圖1可以看出，鎘暴露后斑馬魚胚胎死亡率隨著鎘濃度的增加均有不同程度的升高。相對于對照組，鎘暴露后胚胎發(fā)育至2 hpf時死亡率沒有明顯變化，而胚胎發(fā)育至6，10，24 hpf時，其死亡率急劇上升，且 6，10，24 hpf的胚胎在 8.90，17.80，26.70，35.60 μmol/L鎘濃度暴露下死亡率極顯著升高（P＜0.01）。

2.2 鎘暴露后斑馬魚早期胚胎畸形率分析

鎘暴露后，發(fā)育至2，6，10，24 hpf的胚胎畸形率均隨鎘濃度增加逐漸升高。如圖2，3，4，5所示，2，10 hpf的胚胎畸形率在鎘濃度為17.80 μmol/L時顯著增加（P＜0.01），而 6，24 hpf的胚胎畸形率在鎘濃度為8.90 μmol/L時極顯著升高（P＜0.01）。對照組2 hpf的胚胎發(fā)育到64細(xì)胞期，胚胎動物級均勻快速分裂（圖2-A），而鎘濃度組胚胎出現(xiàn)包狀突起、未分裂、異常分裂、分裂延遲甚至分裂停止等畸形表型（圖2-B～F）。

胚胎發(fā)育至6，10 hpf時，胚胎分別處于原腸期和體節(jié)期，此時可觀察到對照組胚胎分別處于50%下包（圖3-A）和3-體節(jié)時期（圖4-A），而鎘處理組中部分胚胎表現(xiàn)出發(fā)育滯后、外包延遲甚至引起死亡等現(xiàn)象（圖3-B～D，圖4-B～D）。

胚胎發(fā)育至24 hpf，主要的組織器官原基已形成。如圖5-A所示，正常胚胎可觀察到明顯的體節(jié)、眼睛以及心臟搏動等，而鎘濃度組中出現(xiàn)了卵黃囊水腫、心包水腫、尾部彎曲及發(fā)育滯后等多種畸形現(xiàn)象（圖5-B～D），且鎘濃度越高，胚胎畸形程度越嚴(yán)重，尤其在高濃度鎘處理下大部分胚胎出現(xiàn)卵膜被破環(huán)，內(nèi)容物溢出的現(xiàn)象。

2.3 鎘對斑馬魚早期胚胎的氧化損傷

2.3.1 鎘對斑馬魚早期胚胎MDA含量的影響 由圖6可知，鎘暴露后，2，24hpf的斑馬魚胚胎MDA含量的變化趨勢基本一致，均隨著鎘濃度的增加逐漸升高。與對照組相比，在較低的鎘濃度（8.90μmol/L）暴露下，MDA含量沒有明顯變化；在鎘濃度高于17.80 μmol/L時MDA含量均顯著升高（P＜0.05）。

2.3.2 鎘對斑馬魚早期胚胎SOD活性的影響 由圖7可知，與對照組相比，鎘暴露后，2，24 hpf胚胎的SOD活性均發(fā)生了顯著性變化。8.90μmol/L鎘暴露后，2hpf胚胎的SOD活性顯著升高（P＜0.01），而24 hpf胚胎的SOD活性無顯著性變化；17.80 μmol/L鎘暴露下24 hpf的胚胎SOD活性被顯著抑制（P＜0.05）；35.60 μmol/L鎘暴露下，2，24 hpf的胚胎 SOD活性均被顯著抑制。

3 討論

水生動物對環(huán)境污染物的敏感程度在整個生命周期中有所不同。在魚類早期胚胎發(fā)育中，原腸胚階段和細(xì)胞分裂階段是發(fā)育的關(guān)鍵時期[16]。MCKIM等[17]對4種魚類的完整生命周期進(jìn)行了毒性試驗，結(jié)果表明，胚胎、仔魚和早期幼魚是魚類尤為敏感的生命階段。因此，本試驗針對斑馬魚的早期胚胎（2，6，10，24 hpf的胚胎）進(jìn)行了發(fā)育毒性研究。諸多報道指出，重金屬不僅會導(dǎo)致胚胎死亡率、孵化率發(fā)生變化，還會導(dǎo)致胚胎畸形。CHENG等[18]用濃度為1～1 000 μmol/L的鎘暴露5 hpf的斑馬魚胚胎18 h后發(fā)現(xiàn)，鎘可導(dǎo)致胚胎畸形率增加，引發(fā)頭部發(fā)育不全，色素減退，心臟水腫，卵黃囊異常和尾部畸形。辛琦等[19]研究發(fā)現(xiàn)，納米銀和銀離子暴露后，96 hpf斑馬魚胚胎的死亡率升高、孵化率下降，并出現(xiàn)體長縮短及卵黃囊腫大的畸形癥狀。與之相似的是，本研究顯示，鎘暴露后各個發(fā)育階段的胚胎死亡率和畸形率均升高，證實鎘對早期胚胎發(fā)育具有較強(qiáng)毒性。此外，鎘暴露下6，10，24 hpf的胚胎死亡率顯著增加，這可能是由胚胎發(fā)育至不同階段對鎘的敏感性不同所導(dǎo)致。如乙草胺對中華大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans）早期胚胎的毒性研究中發(fā)現(xiàn)，早期胚胎對乙草胺的敏感性和耐受性因發(fā)育階段不同而有所差異，原腸胚階段是胚胎對乙草胺尤為敏感的時期[20]。與之相似，本研究中，6，24 hpf胚胎畸形率在鎘濃度較低時表現(xiàn)出顯著性，由此得出，6，24 hpf胚胎對鎘的敏感性較強(qiáng)。

抗氧化防御系統(tǒng)在氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮重要作用，一旦被破壞，就會導(dǎo)致氧化損傷?？寡趸福⊿OD，CAT）和脂質(zhì)過氧化物（MDA）是檢測各種化學(xué)物質(zhì)和重金屬毒性的標(biāo)志物[21-22]。有關(guān)文獻(xiàn)表明，膜系統(tǒng)遭受損害與MDA有關(guān)，鎘進(jìn)入細(xì)胞會破壞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜功能受損[23]。HSU 等[24]報道，1，3，5，9 μmol/L鎘處理斑馬魚胚胎9 h后，MDA含量極顯著性增加（P＜0.01）。本研究顯示，17.80，35.60μmol/L鎘暴露胚胎2，24 hpf后，MDA含量發(fā)生顯著變化。推測可能是較高濃度鎘會在生物體內(nèi)大量積累，誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的氧自由基，進(jìn)一步破壞機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)，引起內(nèi)環(huán)境失衡，膜系統(tǒng)損傷，從而導(dǎo)致MDA含量呈明顯升高趨勢。

SOD是生物體內(nèi)清除氧自由基從而保護(hù)機(jī)體的第一道防線。本研究SOD活性試驗結(jié)果顯示，鎘暴露后，2 hpf胚胎的SOD活性先升高后降低。與文獻(xiàn)的報道相似，如JIN等[25]通過鎘對鯽魚的毒性試驗發(fā)現(xiàn)，隨著鎘濃度增加，SOD活性發(fā)生改變。這可能是由于鎘濃度較低時，誘發(fā)SOD活性升高，使得機(jī)體自身的抗氧化系統(tǒng)防御能力增強(qiáng)，有效去除氧自由基，防止細(xì)胞膜系統(tǒng)過氧化，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；鎘濃度較高時，可能導(dǎo)致SOD中的金屬離子被置換，引起SOD活性下降。24 hpf的胚胎在鎘濃度為17.80，35.60 μmol/L時SOD活性均被顯著抑制，這可能是由于隨著鎘暴露時間的延長，使得胚胎鎘積累量增多，鎘會改變SOD分子構(gòu)象，使其活性降低，并且使得O2-參與的經(jīng)多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為水和氧氣的氧化還原反應(yīng)效率降低，從而造成氧化損傷。

綜上所述，鎘對分裂期、原腸期、體節(jié)期和咽囊期胚胎的發(fā)育均具有嚴(yán)重的毒性效應(yīng)，并導(dǎo)致胚胎氧化損傷。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討鎘對魚類胚胎原始生殖細(xì)胞的毒性效應(yīng)機(jī)制提供了理論依據(jù)。