郭桂梅,何 婷,劉成洪,高潤紅,徐紅衛(wèi),李穎波,黃劍華,王亦菲,陸瑞菊

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室，上海 201106)

遠(yuǎn)緣雜交是向栽培品種導(dǎo)入優(yōu)異基因的有效方法，但雜交成功率、結(jié)實率均較低。遺傳背景相同的純合群體可以大幅度減少來自供試材料引起的試驗誤差，但是，其構(gòu)建費時、費力。源于單粒種子的小孢子培養(yǎng)高頻再生技術(shù)可以有效克服上述難題。

大麥小孢子培養(yǎng)技術(shù)已日趨成熟[1-2]，大量再生綠苗的獲得為加快大麥育種進(jìn)程和相關(guān)的機理分析提供了有利條件。陸瑞菊等[3-4]建立了大麥大田取材高效的小孢子培養(yǎng)體系；郭桂梅等[5]建立了溫室單粒種子分蘗穗高效形成技術(shù)。影響游離小孢子培養(yǎng)效率的因素復(fù)雜、繁多，對小孢子培養(yǎng)的供體植株、取材時期、前期預(yù)處理、誘導(dǎo)培養(yǎng)基、分化、植株再生等諸多方面均有研究報道[2]。有關(guān)單株培養(yǎng)的效率研究還未見報道。

本研究以大麥花30經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的加倍單倍體株系為供試材料，在已有研究基礎(chǔ)上[3-9]，于可控的人工氣候室中，研究離體穗預(yù)處理時間、離體小花預(yù)處理時間和誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機氮、有機氮含量以及添加PEG對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的影響，為稀缺大麥資源的種質(zhì)繁殖和創(chuàng)造同一親本來源的群體遺傳材料提供途徑，以更好地開展相關(guān)遺傳機理研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大麥(HordeumvulgareL.)品種花30經(jīng)小孢子培養(yǎng)獲得的加倍單倍體株系(編號6-3)的7株小孢子再生植株(編號6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-10、6-3-20、6-3-23)及6-3-6的4株小孢子再生植株(編號6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)。

1.2 方法

1.2.1 植株培養(yǎng)與取材

11株材料用盆缽種植于人工氣候室，光照強度25 μmol·m-2·s-1，光暗比12/12，溫度22 ℃/18 ℃,濕度70%。參照郭桂梅等[5]的方法，調(diào)節(jié)水、肥、溫度等，促進(jìn)植株分蘗，以獲得足夠多的穗子進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。選取穗中部小花小孢子發(fā)育處于單核早期、中期的穗子，剪去葉片(保留上部兩片葉子基部約1.5 cm)，濕紗布包裹放入保鮮袋中，標(biāo)號，5 ℃冰箱低溫處理。

1.2.2 小孢子培養(yǎng)

將1.2.1中低溫處理的穗子參照陸瑞菊等[10]和Lu等[4]方法進(jìn)行小孢子游離。接種時，穗子的滅菌參照郭桂梅等[11]方法。每個試管接5個穗子的花苞，加入12 mL提取液(60 g·L-1甘露醇、1.1 g·L-1CaCl2、0.976 g·L-1MES、20 mg·L-1秋水仙堿，pH 5.8，下同)，用高速分散器以15 000 r·min-1旋切，150目篩網(wǎng)過濾，濾液700 r·min-1離心5 min，重復(fù)3次，收集小孢子。收集到的小孢子用提取液于25 ℃暗處理2 d后，用21%麥芽糖純化；誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗滌1次，用其將小孢子密度調(diào)節(jié)至1.0×105個·mL-1。取1.0 mL小孢子懸浮液接種于培養(yǎng)皿(35 mm×12 mm)中，Parafilm封口，25 ℃暗培養(yǎng)19 d后將誘導(dǎo)培養(yǎng)基吸干，稱重愈傷組織；然后將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，25℃、12 h光照培養(yǎng)，待再生苗長至3 cm左右進(jìn)行綠苗數(shù)目統(tǒng)計。正常的誘導(dǎo)培養(yǎng)基以N6為基本培養(yǎng)基，其中，KNO3和(NH4)2SO4含量降低一半[KNO3降低至1 415 mg·L-1，(NH4)2SO4降至231.5 mg·L-1]，鐵鹽加倍，并添加90 g·L-1麥芽糖、0.5 mg·L-1KT、1.0 mg·L-12,4-D、0.976 g·L-1MES、400 mg·L-1谷氨酰胺及100 mg·L-1水解干酪素，pH 5.8。分化培養(yǎng)基是以2/3MS為基本培養(yǎng)基，添加30 g·L-1麥芽糖、0.5 mg·L-16-BA、1.5 mg·L-1KT及0.05 mg·L-1NAA，用5.5 g·L-1瓊脂粉固化， pH 5.8。提取液和誘導(dǎo)培養(yǎng)基為過濾滅菌，分化培養(yǎng)基為0.11 Mpa、121 ℃高溫高壓滅菌15 min。

1.2.3 愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的條件優(yōu)化

將不同單株(6-3-4、6-3-6、6-3-10、6-3-23)的離體穗進(jìn)行不同時間(19 d 和32 d)的5℃低溫預(yù)處理后進(jìn)行小孢子培養(yǎng)(同1.2.2)；將不同單株(6-3-10、6-3-20、6-3-23)的離體小花用提取液5 ℃預(yù)處理0 d、1 d和2 d后進(jìn)行小孢子培養(yǎng)(同1.2.2)，測定其產(chǎn)生的愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力，研究低溫預(yù)處理時間和離體小花提取液預(yù)處理時間對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的影響。

將6份單株材料(6-3-1、6-3-4、6-3-6、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的穗子按照1.2.2方法置于5 ℃冰箱預(yù)處理19 d進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基分為正常培養(yǎng)基和1/2無機氮培養(yǎng)基，其中后者是在正常誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上將KNO3和(NH4)2SO4再降低一半[KNO3降低至707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4降至115.75 mg·L-1]；愈傷組織稱重后放入相同的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化，統(tǒng)計綠苗產(chǎn)量。同時將其中的4份單株材料(6-3-4、6-3-7、6-3-20、6-3-23)的小孢子置于1/2無機氮培養(yǎng)基和添加了1 600 mg·L-1谷氨酰胺及400 mg·L-1水解干酪素的1/2無機氮培養(yǎng)基上(有機氮提高4倍)進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)計愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力， 研究無機氮和有機氮對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力的影響。

將4份單株材料(6-3-6-2、6-3-6-4、6-3-6-10、6-3-6-11)的小孢子置于正常誘導(dǎo)培養(yǎng)基和添加了4%PEG的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，分化培養(yǎng)基同1.2.2，統(tǒng)計愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力，研究PEG對此三個指標(biāo)的影響。

1.2.4 測定項目及方法

愈傷組織產(chǎn)量：每皿小孢子培養(yǎng)19 d時產(chǎn)生的愈傷組織量，用mg·皿-1表示； 綠苗產(chǎn)量：每皿愈傷組織分化出的綠苗數(shù)，用株·皿-1表示；再生能力：每100 mg愈傷組織分化出的綠苗數(shù)，用株·100 mg-1愈傷組織表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、DPS V7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體穗5 ℃處理時間對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表1可以看出，單株6-3-10預(yù)處理32 d的愈傷組織產(chǎn)量和綠苗產(chǎn)量高于預(yù)處理19 d，而其他3份單株都是預(yù)處理19 d的效果優(yōu)于32 d，其中，6-3-4和6-3-6差異達(dá)顯著水平。低溫預(yù)處理時間從19 d增加到32 d，所有供試單株的再生能力均下降，4份供試單株中，3份單株的再生能力在處理間差異顯著。6-3-23變幅最大，預(yù)處理19 d 時的愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力分別是預(yù)處理32 d的1.41倍、6.75倍和4.75倍。

* 和 ** 分別表示預(yù)處理32 d與19 d間差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

* and ** mean significant difference between the pretreatments at 19 d and 32 d at 0.05 and 0.01 levels,respectively.

2.2 離體小花提取液預(yù)處理時間對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表2可以看出，提取液預(yù)處理時間對6-3-20的愈傷組織產(chǎn)量無顯著影響，對其綠苗產(chǎn)量、再生能力及其他材料的愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力均有顯著影響，且均隨著處理時間的延長而增加(6-3-10的愈傷組織除外)，不同處理間差異均達(dá)顯著水平(6-3-10除外)。單株6-3-10的離體小花培養(yǎng)的愈傷組織與綠苗情況見圖1A和B。

同行數(shù)據(jù)后不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。表3～5同。

Different letters following data in same row mean significant difference between treatments at 0.05 level.The same in tables 3-5.

2.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機氮含量對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表3可以看出，6份單株材料經(jīng)低無機氮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基處理后，愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量和再生能力均高于對照，其中，3份單株材料的愈傷組織在處理間差異顯著；6份材料的綠苗產(chǎn)量在處理間差異均顯著，增加幅度最大的是6-3-20(圖1C)，達(dá)到8.63倍，增加幅度最小的6-3-23，為1.53倍。5份材料的再生能力在處理間差異顯著。這些結(jié)果表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機氮的降低，有利于胚性愈傷組織的形成，使得更多的愈傷組織能夠在分化培養(yǎng)基上形成綠苗。

2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機氮含量對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表4可以看出，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機氮含量提高后，4份單株材料的愈傷組織產(chǎn)量和綠苗產(chǎn)量均顯著增加，再生能力在處理間差異不顯著；綠苗產(chǎn)量與愈傷組織產(chǎn)量的提高幅度相當(dāng)。推測有機氮的提高使得更多的小孢子脫分化啟動形成愈傷組織(圖1D)，進(jìn)而增加綠苗的數(shù)量。

A和B：小花預(yù)處理0 d、1 d、2 d的愈傷組織與綠苗；C：對照與處理(1/2無機氮)綠苗長勢；D：對照與處理(增加有機氮)愈傷組織。

A and B:Callus and green plants with floret nursing in extraction buffer；C:Green plants in normal and low inorganic nitrogen；D:Callus in normal and high organic nitrogen.

圖1大麥單株小孢子培養(yǎng)的愈傷組織與植株分化

Fig.1Callusgreenplantofbarleymicrosporeculturefromsingledonorplant

表3 無機氮對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響Table 3 Effect of inorganic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

表4 有機氮對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響Table 4 Effect of organic nitrogen on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

2.5 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加PEG對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響

從表5可以看出，PEG的添加對供試單株的愈傷組織產(chǎn)量影響不盡相同，除單株6-3-6-10降低外，其余3株均提高，但僅6-3-6-2提高顯著；PEG的添加使所有單株的綠苗產(chǎn)量均提高，且除單株6-3-6-4外均達(dá)顯著水平；所有單株的再生能力在添加PEG后均顯著提高。

表5 PEG對愈傷組織產(chǎn)量、綠苗產(chǎn)量及再生能力的影響Table 5 Effect of the addition of PEG on callus yield,green plantlet yield and regeneration capacity

3 討 論

在早期的花藥培養(yǎng)研究中，離體穗的低溫預(yù)處理和花藥的甘露醇預(yù)處理被廣泛應(yīng)用于大麥花藥培養(yǎng)。雖然直接游離大麥小孢子也能獲得再生植株[12]，但是離體穗的低溫預(yù)處理有助于游離小孢子的脫分化啟動[13-15]，甘露醇(提取液主要成分)預(yù)處理的培養(yǎng)效果也得到證實[16]。這種簡單易行且非常有效的預(yù)處理方法在大麥、青稞和水稻的小孢子培養(yǎng)上同樣被廣泛采用[7,17-18]。本研究以大麥小孢子培養(yǎng)的單株為取材對象，比較了離體穗5 ℃處理19 d和32 d的培養(yǎng)效果，發(fā)現(xiàn)離體穗經(jīng)過19 d的低溫預(yù)處理后，小孢子更容易啟動脫分化程序，且形成的愈傷組織質(zhì)量好，具有更大的綠苗分化潛力，但這種效果會隨著供試單株不同而有所差異。小花或未成熟子房的共培養(yǎng)，可以促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)生[4,19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，在小孢子游離前用提取液預(yù)處理小花1～2 d，也可以促進(jìn)小孢子胚胎的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)愈傷組織的形成和綠苗的分化。

培養(yǎng)基的選擇是植物離體培養(yǎng)中最能體現(xiàn)人為調(diào)控作用的因素之一，培養(yǎng)基中氮源的重要性在大麥花藥培養(yǎng)上早已證實。早期的工作以MS培養(yǎng)基和略作修改的MS培養(yǎng)基最普遍，后來N6、C17和W14培養(yǎng)基的發(fā)明及應(yīng)用極大地推動了禾本科植物組織培養(yǎng)和花藥培養(yǎng)的進(jìn)步[21-22]。將MS培養(yǎng)基中NH4NO3含量降低至165 mg·L-1對大麥花藥培養(yǎng)的成功至關(guān)重要[23]，培養(yǎng)基中無機氮源的影響在大麥小孢子培養(yǎng)上早已證實[7,9,24]。但有機氮的作用有爭議，有研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺會使白苗的數(shù)量大幅度增加[25]；谷氨酰胺的添加對水稻愈傷誘導(dǎo)具有基因型的選擇，而且不能夠提高植株的再生頻率[26]。也有研究表明，培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺能夠促進(jìn)水稻愈傷的誘導(dǎo)以及綠苗再生[27]；水解干酪素的添加能夠提高大麥花藥培養(yǎng)中綠苗率，降低白苗的數(shù)量[28]。本研究結(jié)果表明，適當(dāng)降低誘導(dǎo)培養(yǎng)基中無機氮含量[KNO31 415～707.5 mg·L-1，(NH4)2SO4231.5～115.5 mg·L-1]，能顯著提高單株小孢子培養(yǎng)綠苗產(chǎn)量，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中有機氮源含量提高，可以大幅度提高大麥小孢子離體培養(yǎng)的愈傷組織產(chǎn)量，從而提高綠苗產(chǎn)量。

PEG作為滲透脅迫物質(zhì)可以對植物造成水分脅迫，因而被廣泛應(yīng)用于植物抗旱性鑒定研究。有研究表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入較低濃度的PEG(80～100 mg·L-1)，可以提高小麥花藥培養(yǎng)的出愈率，PEG濃度達(dá)到120 mg·L-1時對供試材料的花藥出愈起到脅迫作用，在小麥的花藥培養(yǎng)中，供試材料整株水平的抗旱性與細(xì)胞水平的抗旱性存在著內(nèi)在的關(guān)系[29-30]。小孢子培養(yǎng)必須采用液體培養(yǎng)方式，而通氣差是液體培養(yǎng)的致命缺點。為了改善液體培養(yǎng)基中的通氣條件，有研究表明，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加Ficoll能提高綠苗得率[31]，不過Ficoll比較貴，在以育種為目的的小孢子培養(yǎng)中不常使用。我們在本試驗中觀察到，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了4%的PEG后，培養(yǎng)的小孢子很多呈漂浮狀態(tài)，而對照培養(yǎng)基中小孢子一般都下沉在培養(yǎng)皿的底部。因此，推測PEG的作用類似Ficoll，通過改善通氣條件使得愈傷組織的質(zhì)量有了提高，從而提高了愈傷組織的綠苗再生能力，使綠苗產(chǎn)量有了大幅度提高。