申玉霞，郭利建，馬 猛，2，趙惠賢，2，劉香利，2

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100； 2.旱區(qū)作物逆境分子生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

14-3-3蛋白是在腦組織中首先發(fā)現(xiàn)的一種可溶性蛋白，依據(jù)該蛋白經(jīng)二乙氨乙基纖維素(DEAE cellulose)柱層析后所占分離組分的片段數(shù)及在淀粉凝膠電泳中的遷移率而命名[1]。14-3-3蛋白廣泛存在于植物中，迄今，已在菠菜(Spinaciaoleracea)、大麥(Hordeumvulgare)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、番茄(Lycopersiconesculentum)、水稻(Oryzasativa)和二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)[2]等植物中發(fā)現(xiàn)該蛋白。目前，已從二十多種植物中克隆和鑒定到14-3-3蛋白基因，其為多基因家族，不同家族成員在結構上都表現(xiàn)出極大的相似性；對模式植物擬南芥的研究結果表明，14-3-3蛋白有13個成員，中間區(qū)域高度保守，但其N-端和C-端均具有較高的變異性，N端的氨基酸殘基對14-3-3蛋白二聚體的形成及其與配體的結合具有重要的作用[3]。14-3-3蛋白家族成員具有多種功能，主要表現(xiàn)在參與植物光合作用、基礎代謝、生長發(fā)育、激素信號途徑以及生物和非生物脅迫響應等方面[4-5]?；蛐酒囼灲Y果顯示，水稻和擬南芥中14-3-3蛋白的表達都受到生物和非生物脅迫的調(diào)控[6-7]。大量的研究表明，14-3-3基因在植物非生物脅迫耐受中起重要作用，擬南芥中的14-3-3同源蛋白GRF6能與過氧化氫酶體的抗壞血酸過氧化物酶和錨蛋白復合體互作，在棉花中超表達GRF6基因能提高棉花的抗旱性[8]。從禾本科模式植物二穗短柄草中鑒定出7個14-3-3蛋白，且7個蛋白對高溫、重金屬、ABA、水楊酸、NaCl和PEG等多種脅迫處理均有響應[9]。在擬南芥中過表達二穗短柄草BdGF14a基因的植株，其抗旱性顯著提高[10]；在煙草中過表達轉二穗短柄草BdGF14d基因的植株，其對鹽的耐受性增強。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ABA信號傳導、ROS清除系統(tǒng)和離子轉運蛋白都參與了增強BdGF14d基因過表達植株對鹽脅迫的耐受性[11]。

非生物逆境脅迫是造成小麥減產(chǎn)的重要因素。因此，對小麥逆境脅迫相關蛋白進行研究具有非常重要的意義。本課題組前期通過分析野生一粒小麥在干旱脅迫下的主要蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在干旱脅迫下顯著上調(diào)[12]，然而關于小麥中14-3-3蛋白的相關研究較少。因此，本研究從普通小麥中克隆小麥14-3-3蛋白家族TaWIN1基因，并對其在不同組織器官和干旱、高溫、低溫和鹽脅迫下的表達模式進行分析，以期為進一步研究小麥14-3-3蛋白基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通小麥(Triticumaestivum)品種中國春由本實驗室保存，選擇籽粒飽滿的種子，先用75%的乙醇消毒45 s，蒸餾水沖洗3次，再用0.2 %的次氯酸鈉消毒5 min，蒸餾水沖洗3次，室溫下于100 r·min-1搖床過夜。隨后，將種子鋪在裝有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光/暗周期為16/8 h，相對濕度為70%，水培至一葉一心期；之后用1/2 Hongland營養(yǎng)液培養(yǎng)至兩葉一心期，再分別用0.2 mol·L-1的NaCl和15% 的PEG-6000進行處理，高溫脅迫組置于40 ℃環(huán)境培養(yǎng)，低溫脅迫組置于4 ℃環(huán)境培養(yǎng)。分別在處理的0、1、2、6、12、24和48 h取根和葉，用液氮速凍后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 小麥 TaWIN1基因的克隆

根據(jù)NCBI中TaWIN1基因(GenBank登錄號： AB042193.1)的序列，用primerpremier 5.0軟件設計引物TaWIN1-F/TaWIN1-R(表1)。用Plant RNA Kit(OMEGA，美國)提取中國春幼葉RNA，并以總RNA為模板，用PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA synthesis Kit (TaKaRa，日本)進行cDNA第一鏈的合成，以此cDNA為模板進行PCR。PCR體系與程序參考KOD FX(TOYOBO，日本)說明書，其中循環(huán)數(shù)為35，退火溫度為58 ℃，延伸時間為45 s。PCR結束后，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物條帶大小，將與預期目的條帶大小一致的擴增產(chǎn)物進行回收。將回收的目的片段連接至pMD 19-T(TaKaRa，日本)，轉化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定后送西安擎科澤西生物科技有限責任公司進行測序。

1.3 小麥 TaWIN1基因編碼蛋白的生物信息學分析

利用NCBI-ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測TaWIN1基因的開放閱讀框，利用NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測該基因編碼蛋白的保守結構域；利用ExPASy-Protparam(https://www.expasy.org/protparam)預測編碼蛋白的理化性質(zhì)，利用ExPASy-Protscale(https://www.expasy.org/protscale)預測編碼蛋白的疏水性，利用CBS-TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測編碼蛋白的跨膜區(qū)，利用CBS-Signal P(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測編碼蛋白的信號肽，利用ExPASy-COILS(https://embnet.vital-it.ch/software/COILS_form.html)預測編碼蛋白的卷曲螺旋，利用Plant-mPLoc(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預測編碼蛋白的亞細胞定位；利用NCBI-BLASTP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)對編碼蛋白進行同源搜索，利用DNAMAN 軟件對小麥及其他物種的蛋白質(zhì)序列進行多重比對分析，利用MEGA 6.0軟件的Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 本研究使用的引物信息Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 小麥 TaWIN1基因的表達分析

1.4.1 不同組織及發(fā)育階段的表達分析

為了分析TaWIN1基因在小麥不同組織及發(fā)育階段的表達模式，根據(jù)測序結果設計定量引物(表1)。分別提取小麥苗期的根、莖、葉、5 mm幼穗、10 mm幼穗和抽穗期的旗葉以及花后5、10、15和20 d籽粒的總RNA，反轉錄后以cDNA為模板，以小麥GAPDH基因作為內(nèi)參基因，使用GoTaq○RGreen Master Mix(Promega，美國)進行qRT-PCR，反應體系與程序參考說明書。每個樣品重復三次，qRT-PCR數(shù)據(jù)用2-△△CT法進行分析，定量結果用Duncan法進行多重比較分析。

1.4.2 不同非生物脅迫處理下的表達分析

分別提取各處理幼苗葉和根的總RNA，反轉錄后進行qRT-PCR分析。方法同上。

2 結果與分析

2.1 TaWIN1基因克隆結果

以中國春幼葉RNA反轉錄的cDNA為模板，RT-PCR擴增得到一條與預期的801 bp大小一致的特異性條帶(圖1)，克隆后測序，序列分析正確，說明得到了小麥TaWIN1基因。開放閱讀框預測結果表明，該基因含有一個801 bp的完整開放閱讀框；保守結構域預測結果表明，該基因編碼蛋白含有完整的14-3-3蛋白家族結構域。以上結果初步表明，本研究克隆得到的基因為TaWIN1基因。

M:D2000; 1:PCR 產(chǎn)物。

M:D2000 DNA maker; 1:PCR product.

圖1TaWIN1基因的擴增產(chǎn)物

Fig.1PCRproductofTaWIN1gene

2.2 TaWIN1基因編碼蛋白的生物信息學分析

對TaWIN1基因編碼蛋白進行預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白編碼266個氨基酸，其分子量為30.22 kDa，理論等電點(pI)為4.75，屬于酸性蛋白；氨基酸殘基中絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸所占的比例分別為8.3%、3.4%和4.1%，說明該蛋白為親水性蛋白，且沒有跨膜區(qū)域；亞細胞定位預測結果表明，編碼蛋白可能定位于細胞質(zhì)；該蛋白有兩個14-3-3蛋白家族典型的卷曲螺旋結構。

利用TaWIN1蛋白序列在NCBI中在線搜索不同物種中與小麥TaWIN1蛋白序列同源性較高的蛋白，蛋白結構域和序列比對結果如圖2所示，小麥TaWIN1氨基酸序列與大麥的14-3-3E氨基酸序列相似性為99%，與二穗短柄草的GF14d同源性為97%，與玉米、水稻和擬南芥的蛋白同源性分別為92.48%、92.48%和77.82%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，雙子葉植物與單子葉植物的蛋白在進化上明顯分成兩支，與小麥TaWIN1蛋白親緣關系近的有大麥、二穗短柄草、水稻等單子葉植物(圖3)。

2.3 小麥 TaWIN1基因表達分析

2.3.1 小麥TaWIN1基因在不同組織中的表達

以中國春根、莖、葉、旗葉、5 mm幼穗和10 mm幼穗，以及花后5、10、15和20 d籽粒cDNA為模板，對TaWIN1基因進行表達分析，結果(表2)表明，該基因在小麥各個發(fā)育時期和組織中都有表達，在根中表達量最低，在葉、旗葉和幼穗中表達量相對較高，其中在10 mm幼穗中表達量最高，說明該基因可能與小麥籽粒發(fā)育有關。

2.3.2 小麥TaWIN1基因在非生物逆境脅迫下的表達

用qRT-PCR對干旱、鹽、熱和低溫處理0、1、2、6、12、24和48 h的根和葉中TaWIN1基因的相對表達量進行分析。結果(表3)表明，TaWIN1基因的表達在不同處理下隨時間變化表達模式有差異。在干旱脅迫處理下，該基因在根和葉中的表達量均顯著上調(diào)，12 h均達到最高，根中表達量是對照的120倍。鹽脅迫下，葉片中TaWIN1基因表達量顯著上調(diào)，1 h達到最高；根中的表達量隨著脅迫處理時間的延長先下調(diào)后上調(diào)，6 h達到最高。高溫脅迫處理下，該基因在葉中的表達量均顯著下調(diào)，而根中的表達量隨著脅迫處理時間的延長先下調(diào)后上調(diào)，24 h達到最高，為對照的10倍。低溫脅迫下，根和葉中的表達量先顯著上調(diào)，而后下調(diào)。以上研究結果表明，TaWIN1基因可能參與小麥對干旱、鹽、熱和低溫脅迫的響應。

方框表示14-3-3蛋白家族結構域。Box indicates the 14-3-3 protein family domain.Ta:Triticumaestivum; Zm:Zeamays; Os:Oryzasativa; At:Arabidopsisthaliana; Bd:Brachypodiumdistachyon:Hv:Hordeumvulgare.

圖2小麥TaWIN1蛋白與其他植物同源蛋白的氨基酸序列比對

Fig.2MultiplealignmentoftheaminoacidsequenceofwheatTaWIN1withhomologousproteinsofotherspecies

圖3 TaWIN1蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of TaWIN1 protein

表2 TaWIN1基因在小麥不同組織中的相對表達量Table 2 Relative expression of TaWIN1 gene in different tissues

同列數(shù)據(jù)后的小寫字母不同表示不同組織間差異顯著(P<0.05)。

Different lower-case letters in the same column indicate significant differences amang tissues(P<0.05).

表3 小麥 TaWIN1基因在不同非生物逆境脅迫下的相對表達量Table 3 Relative expression of TaWIN1 gene under different abiotic stresses

同列數(shù)據(jù)后的小寫字母不同，表示不同處理時間之間差異顯著(P<0.05)。

Different lower-case letters in the same column indicate significant differences amang different time after treatment(P<0.05).

3 討 論

14-3-3蛋白在真核生物中高度保守，對擬南芥14-3-3蛋白的一級結構的分析結果表明，其N端同源性較低(14%)，中間區(qū)域同源性高(51%)。對其N端12-30氨基酸殘基進行突變后發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白不能形成二聚體，同時失去與一些靶蛋白的結合能力，說明N端的氨基酸殘基區(qū)對14-3-3蛋白二聚體的形成及其與配體的結合具有重要的作用[13]。14-3-3蛋白通過與其他蛋白相結合來發(fā)揮作用，可以同時與2個靶蛋白或者1個靶蛋白的2個結構域相互作用。序列比對發(fā)現(xiàn)，小麥TaWIN1基因含有14-3-3家族保守結構域，且與大麥Hv14-3-3E和二穗短柄草BdGF14d高度同源。

14-3-3蛋白在植物體內(nèi)執(zhí)行著多種多樣的功能，并被證實與植物非生物脅迫，如干旱、鹽、極端溫度和氧化脅迫有關。與TaWIN1同源性最高的大麥Hv14-3-3E的表達量受ABA誘導上調(diào)6～8倍，酵母雙雜顯示其可以與大麥的HVABI5發(fā)生互作[14]。多項研究表明，二穗短柄草中BdGF14d基因在高溫、低溫和ABA處理下均顯著上調(diào)[9-11]。Ikeda等[15]在研究小麥WPK4蛋白激酶信號轉導途徑相關蛋白時，利用酵母雙雜的方法發(fā)現(xiàn)了兩個cDNA克隆TaWIN1和TaWIN2，其編碼蛋白可通過自身C端的絲氨酸自身磷酸化與WPK4結合。本研究發(fā)現(xiàn)，TaWIN1基因在PEG處理和低溫以及鹽脅迫下根和葉片中的表達量均顯著上調(diào)，說明TaWIN1基因可能參與小麥非生物逆境脅迫響應，其具體功能有待進一步研究。