宋瑞紅 沈魏 魯立文

[摘要] 目的 探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）在肺結(jié)核和肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值。 方法 選取2014年6月～2017年6月于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院住院治療的疑診為活動性肺結(jié)核和肺外結(jié)核的患者200例，進(jìn)行外周血T-SPOT.TB、皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）和萋-尼抗酸染色（AFB）的檢測，并比較3種方法的診斷價(jià)值。 結(jié)果 T-SPOT.TB、PPD和AFB試驗(yàn)診斷結(jié)核病的敏感性、特異性、陰性預(yù)測值及精準(zhǔn)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及精準(zhǔn)度高于PPD和AFB（P < 0.05）;T-SPOT.TB診斷肺外結(jié)核的敏感性、陰性預(yù)測值及精準(zhǔn)度均高于PPD和AFB（P < 0.05），而PPD與AFB比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核具有較高敏感性和特異性，是快速診斷結(jié)核感染的有效手段，值得臨床應(yīng)用推廣。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn);肺結(jié)核;肺外結(jié)核

[中圖分類號] R446.6? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0157-05

結(jié)核病一直是危及人類健康的重大傳染病，我國是全球22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，位居全球第2位[1]。肺外結(jié)核是指發(fā)生在肺部以外各部位結(jié)核病，可表現(xiàn)為多系統(tǒng)、多部位、多臟器、多類型的結(jié)核，臨床表現(xiàn)多樣，缺乏特異性，臨床診斷較肺結(jié)核更具有難度，容易漏診和誤診[2]。目前，診斷結(jié)核的主要方法包括抗酸染色、結(jié)核桿菌培養(yǎng)、病理學(xué)檢查和皮膚結(jié)核菌素試驗(yàn)（PPD）等，存在檢出率低、耗時(shí)長、有創(chuàng)傷、影響因素廣泛等局限性，對臨床診斷結(jié)核幫助有限[3-4]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）是近年來一種新的結(jié)核病診斷方法，具有異性好、靈敏度高、快速簡便、耗時(shí)少等特點(diǎn)[5]。國外研究已證明T-SPOT.TB對肺結(jié)核和肺外結(jié)核診斷具有明顯的效果，但國內(nèi)尚缺乏相關(guān)的臨床研究，尤其是肺外結(jié)核[6-7]。因此，本研究以活動性肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者為研究對象，觀察T-SPOT.TB的診斷效能，探討T-SPOT.TB在肺結(jié)核和肺外結(jié)核診斷中的應(yīng)用價(jià)值，旨在尋找快速、準(zhǔn)確地結(jié)核病診斷方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年6月～2017年6月于上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院（以下簡稱“我院”）住院治療的疑診為活動性肺結(jié)核和肺外結(jié)核的患者200例，其中男121例，女79例，年齡34～76歲，平均（57.43±8.50）歲，均經(jīng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)、組織病理結(jié)果、醫(yī)學(xué)影像學(xué)結(jié)果及臨床癥狀明確診斷。最終確診結(jié)核患者127例，非結(jié)核患者73例，結(jié)核患者包括肺結(jié)核為63例，肺外結(jié)核64例，其中肺外結(jié)核包括結(jié)核性胸膜炎48例、骨結(jié)核7例（包括胸椎、腰椎）、結(jié)核性腹膜炎3例、淋巴結(jié)核2例，泌尿系結(jié)核2例，淋巴性腦膜炎1例，附睪結(jié)核1例。納入標(biāo)準(zhǔn)：合并咳嗽、咳痰、咳血、消瘦、低熱、乏力等體征和癥狀;檢查胸片時(shí)存在肺結(jié)核典型改變，檢查痰涂片時(shí)存在呈陽性的抗酸桿菌;穿刺檢查胸腔積液時(shí)，滲出液為穿刺液，且在液體標(biāo)本中存在較多的淋巴細(xì)胞;通過抗結(jié)核治療后，臨床療效顯著，但是抗炎治療的臨床效果不顯著。排除標(biāo)準(zhǔn)：肺結(jié)核復(fù)治者或初治≥2周者;存在急性病毒性感染、獲得性免疫缺陷綜合征、矽肺、糖尿病、腫瘤或其他會導(dǎo)致免疫功能異常的疾病;人免疫缺陷病毒檢測抗體陽性。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測方法? ①實(shí)驗(yàn)步驟：整個實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照試劑盒（oxford immunotec ltd，UK）說明書操作。采集外周血5 mL，采用密度梯度離心法分離制備外周單個核細(xì)胞，并移至潔凈離心管中，無血清培養(yǎng)液AIM-V洗滌細(xì)胞，去除內(nèi)源性γ干擾素（IFN-γ）。制備250萬細(xì)胞/mL的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞稀釋液，取出培養(yǎng)板，標(biāo)記并依次加入AIM-V無血清培養(yǎng)液50 μL、抗原A50 μL，抗原B50 μL和陽性對照50 μL，并每孔加入100 μL含25萬PBMC的細(xì)胞稀釋液。將培養(yǎng)板放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16～20 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌4遍，各孔內(nèi)加入新鮮配制的酶標(biāo)抗體溶液50 μL，4℃孵育1 h。再采用PBS洗滌4遍，酶聯(lián)顯色，干燥培養(yǎng)板。ELISPOT自動計(jì)數(shù)儀下對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。②結(jié)果判定[8]：當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5，陽性樣本應(yīng)為：（抗原A或抗原B斑點(diǎn)數(shù)）-（陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)）≥6;當(dāng)陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6，陽性樣本應(yīng)為（抗原A或抗原B斑點(diǎn)數(shù)）≥2 ×（陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)）。

1.2.2 萋-尼抗酸染色法（AFB）和PPD? AFB參照張嫻[9]的方法。PPD采用0.1 mg含5 μl結(jié)核菌素，并在72 h后觀察結(jié)果。一般陽性反應(yīng)為硬結(jié)直徑≥5 mm，強(qiáng)陽性反應(yīng)為硬結(jié)直徑≥10 mm表示結(jié)核感染。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

以最終診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算T-SPOT.TB、AFB及PPD診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及精確度。敏感性為真陽性人數(shù)/（真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%;特異性為真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%;陽性預(yù)測值為真陽性人數(shù)/（真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù)）×100%;陰性預(yù)測值為真陰性人數(shù)/（真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù)）×100%;精確度為[真陽性數(shù)+真陰性數(shù)/（真陽性數(shù)+假陽性數(shù)+真陰性數(shù)+假陰性數(shù)）×100%]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同方法鑒別診斷結(jié)核病的效能比較

T-SPOT.TB診斷為結(jié)核病患者135例，其中，最終確診者115例;診斷為非結(jié)核病患者65例，其中53例被最終確診;PPD診斷為結(jié)核病患者132例，其中，最終確診者101例，診斷為非結(jié)核病患者68例，其中42例被最終確診;AFB診斷為結(jié)核病患者132例，其中，最終確診者85例，診斷為非結(jié)核病患者68例，其中26例被最終確診。T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的敏感性、特異性、陰性預(yù)測值及精準(zhǔn)度均高于AFB和PPD（P < 0.05）。見表1。

2.2 不同方法鑒別診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核的效能比較

T-SPOT.TB診斷為肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者分別為65例和62例，最終確診肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者分別58例和57例;PPD診斷為肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者分別為70例和57例，最終確診肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者分別50例和48例;AFB診斷為肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者分別為65例和62例，最終確診肺結(jié)核患者和肺外結(jié)核患者分別45例和44例。T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及精準(zhǔn)度均高于PPD和AFB（P < 0.05）。見表2。T-SPOT.TB診斷肺外結(jié)核的敏感性、陰性預(yù)測值及精準(zhǔn)度均高于PPD和AFB（P < 0.05），而PPD與AFB比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

3 討論

3.1 目前我國結(jié)核病診斷現(xiàn)狀

痰涂片結(jié)核菌AFB和PPD是我國目前最主要的結(jié)核病檢測方法。在無法進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)的情況下，痰涂片結(jié)核菌AFB可謂診斷肺結(jié)核的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是其結(jié)果的判斷受到檢測者涂片質(zhì)量、染色時(shí)間、閱鏡經(jīng)驗(yàn)等主觀因素影響，同時(shí)還受到疾病所處的時(shí)期有關(guān)，故假陽性率高、漏診率較大[9-10]。PPD的靈敏度水平受患者免疫力狀況、營養(yǎng)狀況、卡介苗接種等多種因素影響，假陽性率較高，大大影響了其臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。在本研究中，PPD和AFB對結(jié)核病的敏感性分別為79.53%、66.93%，而進(jìn)一步細(xì)化觀察發(fā)現(xiàn)，對肺結(jié)核的敏感性分別為79.37%、71.42%，對肺外結(jié)核的敏感性為75.00%，66.67%，與其他研究結(jié)果類似，提示痰涂片結(jié)核菌AFB和PPD在臨床中診斷結(jié)核病的應(yīng)用價(jià)值都比較低[12-14]。

3.2 T-SPOT.TB在結(jié)核病診斷中具有較高的應(yīng)用價(jià)值

近年來，隨著免疫學(xué)檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，以酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）為檢測方法的結(jié)核感染T細(xì)胞檢測方法（T-SPOT.TB）作為一種新的結(jié)核病診斷方法逐漸建立并發(fā)展起來，被廣泛的應(yīng)用于結(jié)核感染篩查[15-16]。感染結(jié)核分枝桿菌的機(jī)體存在結(jié)核特異性記憶T淋巴細(xì)胞，當(dāng)再次遇到結(jié)核特異性抗原刺激時(shí)，轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，釋放IFN-γ，靶抗原6（ESAT-6）和過濾蛋白10（CFP-10）是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因RD1區(qū)域rv3875和rv3874編碼的結(jié)核特異性蛋白抗原，可從MTB感染者的T細(xì)胞中誘導(dǎo)出較強(qiáng)的IFN-γ釋放反應(yīng)，根據(jù)以上原理而設(shè)計(jì)的T-SPOT.TB技術(shù)是目前最敏感的檢測結(jié)核抗原特異性T淋巴細(xì)胞的技術(shù)[17-18]。在本研究中，T-SPOT.TB診斷結(jié)核病的敏感性、特異性及精準(zhǔn)度分別為90.55%（115/127）、72.60%（53/73）、84.00%（168/200），均明顯高于AFB和PPD（P < 0.05），提示T-SPOT.TB對結(jié)核病的診斷具有較好的效果。

3.3 T-SPOT.TB對肺結(jié)核和肺外結(jié)核均具有較好的診斷效能

本研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及精準(zhǔn)度高于PPD和AFB（P < 0.05）。班麗芳[19]研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的的準(zhǔn)確率明顯高于PPD。闞景雙等[20]研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核的敏感性為95.1%，高于包括PPD，血清結(jié)核桿菌抗體、痰涂片結(jié)核分枝桿菌檢測以及支氣管肺泡灌洗液結(jié)核分枝桿菌檢測在內(nèi)的其他各項(xiàng)檢查方法。肺外結(jié)核的臨床表現(xiàn)與多種疾病的表現(xiàn)類似，多在體內(nèi)較深或隱匿部位，不易獲得細(xì)菌學(xué)及病理學(xué)證據(jù)，有些需手術(shù)或穿刺活檢確診，但需考慮患者經(jīng)濟(jì)原因及其依從性，很多患者不能接受，診斷難度高于肺結(jié)核。因此，肺外結(jié)核誤診、漏診極為常見，常因此而延誤治療，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。一項(xiàng)在疑診肺外結(jié)核患者中進(jìn)行的前瞻研究發(fā)現(xiàn)，33%伴有免疫功能不全，免疫功能不全的患者中PPD皮試靈敏度僅有38%，而免疫功能正常患者中為69%[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB診斷肺外結(jié)核病的靈敏性為89.06%，高于AFB和PPD（P < 0.05）。T-SPOT.TB的優(yōu)勢在于不受患者免疫力狀態(tài)和排菌期、排菌量的影響[22-23]。研究顯示，通過使用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原早期分泌ESAT-6和培養(yǎng)CFP-10刺激結(jié)核感染后T淋巴細(xì)胞，分泌的特異性的細(xì)胞因子IFN-γ，并通過ELISPOT技術(shù)，應(yīng)用T-SPOT.TB實(shí)驗(yàn)檢測血液中有無INF-γ，從而可以判斷有無結(jié)核分枝桿菌的感染，不僅靈敏度高、特異性強(qiáng)、而且操作簡單、耗時(shí)少，一般1～2 d就能看到結(jié)果[24-25]。

綜上所述，T-SPOT.TB診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核具有較高敏感性和特異性，是快速診斷結(jié)核感染的有效手段，值得臨床應(yīng)用推廣。

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（收稿日期：2018-06-01? 本文編輯：封? ?華）