李利娟

[摘要] 目的 研究肺結(jié)核患者T輔助細胞、自然殺傷T細胞（NKT細胞）、自然殺傷細胞（NK細胞）水平與疾病發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系。 方法 選取2015年12月～2016年12月四川大學華西廣安醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的肺結(jié)核病患者100例，選取同期我院體檢的健康者100例;根據(jù)初診、復診、結(jié)核菌素情況將其分為四組（Ⅰ～Ⅳ組分別為初診肺結(jié)核組、復診肺結(jié)核組、結(jié)合菌素陽性健康組、結(jié)合菌素陰性健康組）。使用流式細胞儀檢測四組治療前外周血T細胞、NKT、NK細胞表達率。 結(jié)果 與Ⅲ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），兩組T細胞及NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與Ⅳ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），兩組T細胞及NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與Ⅰ組比較，Ⅱ組患者T細胞表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），但兩組NKT細胞及NK 細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;Ⅲ組及Ⅳ組在T細胞、NK、NKT細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。Ⅰ組患者中輕癥、中癥及重癥亞組T細胞表達率差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），表達率：重癥>中癥>中輕癥。三個亞組的NKT細胞及NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。100例肺結(jié)核患者治療后均隨訪6個月，2例痰菌復陽，1例病灶惡化，其余均未復發(fā)。 結(jié)論 初診患者T細胞表達水平與健康者相當，與疾病嚴重程度相關(guān)。復診患者T細胞表達率明顯升高?；顒有越Y(jié)核患者中NKT細胞表達增加。因此，NK、T細胞測定可輔助診斷活動性結(jié)核。

[關(guān)鍵詞] 肺結(jié)核;T輔助細胞;NKT細胞;NK細胞;預(yù)后

[中圖分類號] R521? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0098-04

當結(jié)核分枝桿菌侵入人體時，可激活人體先天性及適應(yīng)性免疫防御反應(yīng)，反應(yīng)強度與癥狀呈正相關(guān)[1]。一些患者感染結(jié)核分枝桿菌后立即變?yōu)榛顒有越Y(jié)核病，但大多數(shù)患者體內(nèi)感染結(jié)核菌會處于終身潛伏感染狀態(tài)[2]。自然殺傷細胞（NK細胞）主要參與先天性免疫，T輔助細胞主要參與適應(yīng)性免疫，自然殺傷T細胞（NKT細胞）為新型的免疫細胞，主要特征為CD3和CD56雙陽[3]。NKT細胞具有NK細胞及T細胞的雙重表型功能，可作為先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的連接紐帶[4]。其作用靶點為結(jié)核分枝桿菌胞壁的磷酯酰肌醇甘露糖，當NKT細胞被激活后，可分泌γ干擾素（INF-γ），抑制結(jié)核菌正?；顒樱⒎置诰哂袣饔玫念w粒素[5]。肺結(jié)核患者免疫作用復雜，本研究探討了肺結(jié)核患者T輔助細胞、NKT細胞及NK細胞的表達，旨在分析上述細胞對結(jié)核病診治及預(yù)后的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年12月～2016年12月四川大學華西廣安醫(yī)院（以下簡稱“我院”）收治的肺結(jié)核病患者100例，包括61例初診患者和39例復診患者。所有患者均符合《臨床診療手冊（結(jié)核病分冊）》[6]的診斷標準。經(jīng)痰抗酸桿菌涂片檢驗確診為肺結(jié)核，且人類免疫缺陷病毒（HIV）呈陰性。其中男73例，女27例;年齡17～70歲，平均（41.6±6.7）歲。另選取同期我院體檢且X線胸片未見異常的健康者100例。其中56例結(jié)核菌素皮試陽性，44例陰性。根據(jù)初診、復診、結(jié)核菌素情況將其分為四組，各組的基本資料：①初診肺結(jié)核組（Ⅰ組）：共61例，其中男42例，女19例;年齡19～68歲，平均（40.2±5.5）歲。根據(jù)患者的肺部病變、空洞、發(fā)熱等癥狀，由2位醫(yī)生根據(jù)《結(jié)核病的診斷標準和分類（續(xù)1）臨床與X線表現(xiàn)》[7]將患者分為輕癥、中癥及重癥亞組，分別有15、22、24例。②復診肺結(jié)核組（Ⅱ組）：共39例，其中男31例， 女8例;年齡23～71歲，平均（42.6±6.0）歲。③結(jié)核菌素陽性健康組（Ⅲ組）：共56例，其中男21例，女35例;年齡21～67歲，平均（34.7±5.1）歲。④結(jié)核菌素陰性健康組（Ⅳ組）：共44例，其中男16例，女28例;年齡20～67歲，平均（38.9±6.4）歲。四組在治療前的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有入選者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準? ①符合結(jié)核病診斷標準，經(jīng)檢測證實為肺結(jié)核;②同意參與并簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準? ①合并糖尿病、免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病、腫瘤;②痰培養(yǎng)為非結(jié)核分枝桿菌;③合并嚴重疾病;④孕期或哺乳期婦女;⑤HIV感染者及AIDS患者;⑥未收集到完整資料。

1.3 方法

使用EPICS XL流式細胞儀（Beckman Coulter公司，美國）檢測治療前四組的外周血T細胞、NKT、NK細胞表達率。住院第1天清晨采集5 mL空腹肝素鈉抗凝血，進行熒光標記，取100 μL全血與CD3-FITC/（CD16+CD56）-PE抗體室溫下反應(yīng)20 min，OptiLyse C溶血素溶血，磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗滌重懸細胞，流式細胞儀待測。使用EPICS XL SystemⅡTM Version 3.0，分析淋巴細胞的前向散射（FS）與側(cè)向散射（SS）細胞分群，在相應(yīng)的直方圖或散點圖中讀取CD陽性表達率。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用ANOVA，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組的不同細胞表達率比較

與Ⅲ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），T細胞及NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與Ⅳ組比較，Ⅰ組患者NKT細胞表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），T細胞及NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與Ⅰ組比較，Ⅱ組患者T細胞表達率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），NKT細胞及NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;Ⅲ組T細胞、NK、NKT細胞表達率與Ⅳ組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 Ⅰ組中輕癥、中癥及重癥亞組T細胞表達率比較

Ⅰ組患者中輕癥、中癥及重癥亞組T細胞表達率差異有統(tǒng)計學意義（F = 154.493，P < 0.05），表達率：重癥>中癥>中輕癥。三個亞組的NKT細胞、NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2。

2.6 治療后隨訪

100肺結(jié)核患者治療后均隨訪6個月，2例痰菌復陽，1例病灶惡化，其余均未復發(fā)。

3 討論

肺結(jié)核的發(fā)生與年齡、性別、職業(yè)等因素有關(guān)[8]，絕大多數(shù)患者感染結(jié)核分枝桿菌后并不會發(fā)病，主要原因是機體受到刺激后，T細胞介導的細胞免疫會抵抗結(jié)核分枝桿菌，從而產(chǎn)生獲得性免疫。NK細胞為先天性免疫的重要細胞。NKT細胞可增強免疫反應(yīng)，在抗腫瘤、感染、治療自身免疫性疾病、移植中起到重要作用。刺激NKT細胞會產(chǎn)生大量細胞因子，如白細胞介素-4（IL-4）及INF-γ等，從而起到免疫調(diào)節(jié)作用;NKT細胞同時存在NK細胞樣細胞毒活性，可釋放穿孔素、Fas配體等溶解靶細胞，從而起到結(jié)核分枝桿菌作用。鄢仁晴等[9]研究表明，肺結(jié)核患者NKT水平顯著高于正常者，T細胞及NK細胞則無顯著差異，3種細胞水平與年齡、性別等均無顯著相關(guān)性，因此NKT可作為結(jié)核病活動性判斷指標。研究[10]表明，NKT和NK細胞在活動性肺結(jié)核患者體內(nèi)表達率高，且NKT水平顯著低于正常及結(jié)核病接觸者，且其水平在抗結(jié)核治療6個月內(nèi)一直較低。本研究提示，初、復診的肺結(jié)核患者NKT細胞表達率顯著高于健康者，提示肺結(jié)核患者細胞免疫異常表現(xiàn)為NKT細胞增加，加劇了細胞毒性效應(yīng)，患者NKT細胞水平有助于辨認潛伏感染或活動性結(jié)核。結(jié)核菌素陽性健康者的結(jié)核菌相對靜止，未激活NKT細胞，因此其表達與結(jié)核菌素陰性健康者類似，均水平較低[11]。但本研究中各組NK細胞表達率差異無統(tǒng)計學意義，與胥萍等[12]研究結(jié)果相似。

T細胞通過Th1產(chǎn)生INF-γ、CD8+ T細胞，釋放顆粒素、穿孔素，以殺死結(jié)核菌[13-19]。本研究結(jié)果提示，初診肺結(jié)核患者與健康者比較，T細胞表達水平相當。主要原因可能為：①本研究測定了外周血T細胞，并不能完全代表病灶局部變化;②與健康者相比，肺結(jié)核患者CD4+ T細胞水平減少，CD8+ T增加[20-23]。本研究測定CD3+ T細胞，為各亞群變化總和，與健康者相當;③發(fā)病前，初診患者T細胞水平偏低，但本組患者均為HIV陰性，發(fā)病后T細胞增加，使之與健康者水平相當。本研究結(jié)果提示，外周血T細胞與初診患者疾病嚴重程度相關(guān)，T細胞增加，疾病更嚴重，預(yù)后更不好，但與NKT、NK細胞均無明顯相關(guān)性，提示T細胞為主要的免疫反應(yīng)。與初診患者相比，復診患者T細胞表達率顯著增加，可能是由于已致敏細胞反復暴露于病原菌，激發(fā)了強烈增生反應(yīng)，提示復診肺結(jié)核患者免疫反應(yīng)可能與T細胞所有亞群相關(guān)。T細胞檢測有助于了解患者是否復發(fā)。

綜上所述，T細胞、NKT細胞是細胞免疫重要組成部分，可誘導結(jié)核分枝桿菌特異性免疫反應(yīng)。初診患者T細胞表達水平與健康者相當，并與疾病嚴重程度相關(guān)。復診患者T細胞表達率明顯升高[24-25]?；顒有越Y(jié)核患者中NKT細胞表達增加。因此，NKT細胞測定可輔助診斷活動性結(jié)核。本研究測定的細胞均為外周血細胞，與真實的病灶細胞可能存在差異。NKT細胞在發(fā)病不同階段的免疫效應(yīng)及表達率的診斷意義及其與不同疾病的關(guān)系尚需進一步的研究。

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（收稿日期：2018-07-11? 本文編輯：王? ?蕾）