賀旭峰 婁向新 朱華鋒 張慧敏

[摘要] 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS Cell）是一種經(jīng)人工誘導(dǎo)重新編程后產(chǎn)生的多潛能分化干細(xì)胞。目前，iPS細(xì)胞已成功再分化為多種不同的成熟細(xì)胞，其中包括成骨細(xì)胞。因此，利用iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成骨以治療骨組織疾病成為一個(gè)可期待的選擇。本文回顧了iPS細(xì)胞成骨分化的體內(nèi)外研究成果;除此之外，討論了細(xì)胞因子及微小RNA（miRNA）對iPS細(xì)胞成骨分化的作用;最后，綜述了各類支架對于iPS細(xì)胞成骨作用的影響，并分析了相關(guān)優(yōu)缺點(diǎn)，以期為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞;成骨分化;骨重建;成骨細(xì)胞

[中圖分類號] R329? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0049-04

誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell， iPS cell）由日本京都大學(xué)Yamanaka研究小組于2006年率先成功制備，他們利用逆轉(zhuǎn)錄病毒，將Oct3/4、Klf4、Sox2和c-Myc基因轉(zhuǎn)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞內(nèi)，成功將體細(xì)胞重編程為具有多種分化能力的干細(xì)胞。2007年該小組將人類的成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞[1]。iPS細(xì)胞有著與胚胎干細(xì)胞相似的分化能力，目前iPS細(xì)胞已成功地被分化為多種特異性細(xì)胞，相關(guān)細(xì)胞研究涉及帕金森病[2]、糖尿病[3]、肌萎縮側(cè)索硬化癥[4]、血友病[5]、阿爾茨海默病[6]、牙釉細(xì)胞分化[7]等多個(gè)方面。iPS細(xì)胞的出現(xiàn)對于組織工程及干細(xì)胞研究具有劃時(shí)代的意義。

雖然骨組織具有一定的再生能力，但骨缺損及骨不連仍是各種骨折后出現(xiàn)的較難處理的臨床問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有5%～10%的骨折后患者均會(huì)出現(xiàn)不同程度的骨缺損及骨不連[8]。臨床異體植骨有著免疫排斥的問題，自體移植也有諸如二次創(chuàng)傷及高并發(fā)癥等限制，于是將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成骨進(jìn)行治療成為一個(gè)可期待的選擇。目前已有一些相關(guān)研究，現(xiàn)綜述如下：

1 iPS細(xì)胞的成骨分化體外實(shí)驗(yàn)研究

近年來，越來越多人或鼠類iPS細(xì)胞成骨分化研究出現(xiàn)，替代原先只有胚胎干細(xì)胞的情況[9]?；诩韧咛ジ杉?xì)胞技術(shù)，很多研究利用同樣的技術(shù)試圖將iPS細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[10-11]，并取得成功。

Okamoto等[12]利用含有10%胎牛血清（FBS）等成分的培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠iPS細(xì)胞，通過生成胚胎小體（EB）細(xì)胞隨后成骨細(xì)胞分化，將EB細(xì)胞置于含有明膠涂層的培養(yǎng)皿，利用含有地塞米松的培養(yǎng)液培養(yǎng)進(jìn)行體外成骨細(xì)胞分化。另有研究利用未分化的iPS細(xì)胞，用緩沖液去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，然后于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。在EB細(xì)胞形成后，將EB細(xì)胞播種到培養(yǎng)皿上 ，培養(yǎng)5 d后，將形成的細(xì)胞利用過濾器過濾，并培養(yǎng)在誘導(dǎo)成骨液中，進(jìn)行成骨分化[13] 。Tashiro 等[14]通過懸滴法培養(yǎng)獲得EB細(xì)胞，將EB細(xì)胞轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液，培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)3 d，然后在分化培養(yǎng)液中再培養(yǎng)2 d，接著細(xì)胞經(jīng)過載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后在含有明膠涂層培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，最后在成骨分化液中體外成骨分化。

由于體外iPS細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的漸漸成熟，有研究不僅探索了成骨嘗試，并進(jìn)行了相關(guān)成骨檢驗(yàn)和定量。Li等[15]用不同來源生長因子處理的iPS細(xì)胞，并對其進(jìn)行消化處理，然后在成骨分化培養(yǎng)液中培養(yǎng)孵化28 d后，用茜紅素染色觀察定量礦化的程度。Kao等[16]將iPS細(xì)胞放在含有FBS、維生素C等成分的培養(yǎng)基中成骨誘導(dǎo)，得到的細(xì)胞用PBS沖洗然后固定，最后通過馮庫薩染色和茜紅素染色評估成骨分化。

另外，胚胎干細(xì)胞及iPS細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的技術(shù)同樣適用于間充質(zhì)干細(xì)胞[17]。Deyle等[18]通過iPS細(xì)胞生成EB細(xì)胞，在培養(yǎng)液中培養(yǎng)，由此生成的間充質(zhì)干細(xì)胞（iMSC）誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，進(jìn)行體外成骨分化，表達(dá)堿性磷酸酶、RUNX2以及成骨細(xì)胞特有的基因骨鈣素，同時(shí)體外生成礦物質(zhì)。最后利用茜紅素染色確定鈣的存在。

從體外成骨實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，iPS細(xì)胞轉(zhuǎn)化成骨所利用的成骨因子借鑒了之前胚胎干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，基本沿襲了相似的成骨因子（如地塞米松、維生素C等）。再者鮮有iPS細(xì)胞體外直接進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化，大多先將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)為EB細(xì)胞，或者將其培養(yǎng)為間充質(zhì)干細(xì)胞，再進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。結(jié)合筆者經(jīng)驗(yàn)，這很可能與iPS細(xì)胞直接誘導(dǎo)成骨的成功率較低有關(guān)。

2 iPS細(xì)胞的成骨分化體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究

近年來，有研究進(jìn)一步嘗試了體內(nèi)植入iPS細(xì)胞，使其分化為骨組織[19]，該研究顯示人iPS細(xì)胞可在裸鼠實(shí)驗(yàn)中分化為牙周類骨組織，他們將iPS細(xì)胞移植入鼠類牙槽中，結(jié)合牙釉基質(zhì)蛋白復(fù)合體，最終形成牙骨質(zhì)。

體內(nèi)iPS細(xì)胞的研究除了將細(xì)胞直接植入外，很多研究均將細(xì)胞與一些介質(zhì)或支架相結(jié)合進(jìn)行體內(nèi)植入。比如利用羥基磷灰石/磷酸鈣基質(zhì)與iPS細(xì)胞所分化的間充質(zhì)干細(xì)胞相結(jié)合，一起移植到免疫缺陷小鼠身上，8周后取出進(jìn)行研究[18]。Ye等[20]利用絲纖蛋白支架結(jié)合iPS細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行細(xì)胞消化后，將iPS細(xì)胞吸移懸浮在絲纖蛋白支架上，含有iPS細(xì)胞的絲纖蛋白支架經(jīng)孵化后將iPS細(xì)胞與絲素蛋白三維支架復(fù)合體置入顱骨缺損裸鼠模型的顱骨缺損處，觀察其成骨情況。

還有利用明膠海綿作為支架進(jìn)行體內(nèi)成骨的報(bào)道，將明膠海綿浸潤在成骨分化液中，iPS細(xì)胞所分化的成骨細(xì)胞加入明膠海綿，在小鼠背部縱向切開切口，將帶有已分化成骨細(xì)胞的明膠海綿植入切口中縫合，分批培養(yǎng)觀察成骨情況[21]。

此外有報(bào)道將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)所產(chǎn)生的細(xì)胞播種于HA/TCP陶瓷支架上，在37℃孵化2 h，確保細(xì)胞黏附在陶瓷上。再將帶有細(xì)胞的陶瓷支架移植到聯(lián)合免疫缺陷小鼠背部皮下，移植5周后，處死小鼠取出陶瓷支架以研究成骨情況[15]。這項(xiàng)研究已非常接近臨床實(shí)用情況。

通過iPS細(xì)胞體內(nèi)成骨實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，為了避免免疫反應(yīng)，大多利用裸鼠進(jìn)行研究。植入部位有的選擇直接注入皮下，有的則放于骨缺損部位。很明顯，后者研究更具有臨床意義，也是目前研究方向之一。另外，有的實(shí)驗(yàn)選用所分化細(xì)胞直接植入體內(nèi)，也有結(jié)合支架及介質(zhì)植入體內(nèi)研究。目前報(bào)道顯示，細(xì)胞結(jié)合支架的成骨效果明顯好于單純細(xì)胞植入。

除此之外，Polo等[22]研究表明，不同來源誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞，其基因表達(dá)會(huì)有不同，與其來源有關(guān)，不同來源的iPS細(xì)胞似乎仍有與來源相關(guān)的“轉(zhuǎn)錄記憶”。因此，基因重編程及表觀遺傳編程機(jī)制仍需更深入的研究。當(dāng)然，來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的iPS細(xì)胞，其成骨作用已被證實(shí)[13]。因此，我們可以選擇不同來源的iPS細(xì)胞以選擇最優(yōu)的分化方向，但相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

3 細(xì)胞因子及微小RNA在iPS細(xì)胞成骨分化中的作用

在干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中，比較基本的成骨介質(zhì)為胎牛血清、維生素C、甘油磷酸酯以及地塞米松[23-24]。其他促進(jìn)因素包括骨形成蛋白（BMP）[9]及維生素D3[25]。有報(bào)道顯示BMP在干細(xì)胞分化中有著重要的作用[26]。尤其是BMP-2，研究表明在一定條件下對于干細(xì)胞的成骨及成軟骨過程有極強(qiáng)的作用[27]。最近一項(xiàng)進(jìn)展顯示，白藜蘆醇可以促進(jìn)iPS細(xì)胞及胚胎干細(xì)胞的成骨分化。實(shí)驗(yàn)中將細(xì)胞注射到裸鼠背部皮下組織，觀察和測量體內(nèi)成骨情況。實(shí)驗(yàn)顯示，在糖皮質(zhì)激素環(huán)境下誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞成骨實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇可促進(jìn)iPS細(xì)胞分化為類骨細(xì)胞，并減少激素對細(xì)胞的氧化損傷，減少畸胎瘤的發(fā)生率[16]。

許多研究表明，iPS細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞分化時(shí)，對各種因子的反應(yīng)是有所不同的，同時(shí)也報(bào)道了將iPS細(xì)胞定向到特定細(xì)胞的方法[28]。其中，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β家族可增強(qiáng)成骨效應(yīng)及骨重建，Li等[15]的研究揭示了TGF-β1和TGF-β3結(jié)合維A酸，能在體外實(shí)驗(yàn)中更好地使iPS細(xì)胞進(jìn)入“間充質(zhì)狀態(tài)”，促使其成骨分化。另一項(xiàng)研究則顯示僅用維A酸也可促進(jìn)鼠類iPS細(xì)胞的成骨分化與增殖[21]。所有這些體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均說明TGF-β家族至少能促進(jìn)鼠類iPS細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

在iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)有成骨表達(dá)功能的細(xì)胞因子Runx2，可加強(qiáng)iPS細(xì)胞成骨分化。結(jié)果顯示，經(jīng)Runx2轉(zhuǎn)換組的ALP的表達(dá)是無Runx2組的2倍，鈣沉積是其8倍[14]。

還有一些其他控制成骨表達(dá)的因素，比如微小RNA（miRNA）技術(shù)。近期研究表明miRNA在眾多細(xì)胞分化中有著作用[29]，以及多種miRNA在干細(xì)胞成骨分化中有著重要的作用[30]。Okamoto等[12]確定了6種成骨相關(guān)miRNA，包括miR-124a、miR-181a、miR-10a、miR-10b、miR-9-3p、miR-19b，并歸納了這些miRNA在鼠iPS細(xì)胞成骨過程中的具體作用。他們發(fā)現(xiàn)BMP-4誘導(dǎo)的成骨與常規(guī)成骨通路中miRNA抑制調(diào)控有關(guān)，在這過程中，6種miRNA對控制BMP-4誘導(dǎo)的iPS細(xì)胞成骨過程有著重要作用。在以后的研究中，基因治療及應(yīng)用需要更多數(shù)據(jù)，以證實(shí)其有效性及安全性。鑒于已有的臨床應(yīng)用，BMP2/4及Runx2顯得更具研究潛力[31]。

4 支架在iPS細(xì)胞成骨分化的作用

細(xì)胞外基質(zhì)對于維持細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)有著重要作用。組織工程就是要建立合適的3D支架來模擬細(xì)胞外基質(zhì)，使其維持細(xì)胞生長及細(xì)胞分化。有報(bào)道顯示通過在胚胎小體細(xì)胞培養(yǎng)皿中放入聚醚砜納米纖維支架及成骨分化液進(jìn)行培養(yǎng)，成功進(jìn)行體外成骨分化[32]。與此同時(shí)各種材料支架均有文獻(xiàn)報(bào)道對iPS細(xì)胞成骨分化有著促進(jìn)作用。

一些骨缺損動(dòng)物模型研究將iPS細(xì)胞移入生物工程支架以加強(qiáng)骨組織重建再生，在實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)iPS細(xì)胞移植入免疫缺陷小鼠模型后，這些細(xì)胞分裂增殖并形成骨組織[21]。Jin等[33]利用聚己內(nèi)酯3D支架結(jié)合人iPS細(xì)胞成功進(jìn)行了成骨分化，實(shí)驗(yàn)中iPS細(xì)胞支架聯(lián)合體的成骨作用增強(qiáng)并有顯著差異，這顯示以基于iPS細(xì)胞的組織工程支架來治療骨缺損是一個(gè)可能的有效方法。尤為重要的是，在iPS細(xì)胞置入并逐漸誘導(dǎo)成骨進(jìn)行到8周，在成骨部位未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤組織。這篇報(bào)道提示了由iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成骨治療骨缺損是有效及安全的。

同時(shí)，現(xiàn)有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示與支架相結(jié)合，iPS細(xì)胞成骨表達(dá)均有增加，體內(nèi)天然的成骨細(xì)胞外基質(zhì)機(jī)構(gòu)均為納米級，相應(yīng)的細(xì)胞和組織則高度依賴其機(jī)構(gòu)狀態(tài)[34]。近年研究表明iPS細(xì)胞和納米纖維支架結(jié)合有著良好的成骨效果，納米支架漸成替代細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)成骨分化的選項(xiàng)之一。

靜電紡絲技術(shù)為大規(guī)模制造納米級聚合物支架以及組織工程學(xué)提供了重要的技術(shù)支持[35]。靜電紡絲技術(shù)可以任意選擇所需要的組織材料，為目標(biāo)細(xì)胞提供最優(yōu)的模擬細(xì)胞外基質(zhì)。D′Angelo等[36]利用聚乳酸-羥磷灰石納米支架進(jìn)行iPS細(xì)胞分化為間充質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均顯示了穩(wěn)定的成骨分化及增殖。

從目前支架方面研究筆者認(rèn)為除了體外實(shí)驗(yàn)，需加強(qiáng)研究體內(nèi)環(huán)境對于支架影響iPS細(xì)胞分化的作用;另外，各種不同類型支架包括納米支架均對iPS細(xì)胞成骨分化有作用或是增強(qiáng)作用，他們之間的差別有待探討。之后的實(shí)驗(yàn)應(yīng)擴(kuò)展至多種細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞及間充質(zhì)干細(xì)胞等，以探究對骨缺損的治療，并探討及確定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及條件。

綜上所述，雖然目前iPS細(xì)胞研究較多，也有一些令人鼓舞的成果，但要使得應(yīng)用iPS細(xì)胞成骨分化進(jìn)行骨缺損治療成為一種可靠的方法，仍然一些需要解決的問題：①iPS細(xì)胞是否有同胚胎干細(xì)胞一樣，有著持續(xù)的表達(dá)能力;②體內(nèi)植入iPS細(xì)胞是否會(huì)形成畸胎瘤[37]，在誘導(dǎo)其成骨分化時(shí)，又要抑制其成為畸胎瘤;③iPS細(xì)胞進(jìn)行分化及代謝的外環(huán)境的維持。因此仍有很長一段路需要研究人員艱苦探索，iPS細(xì)胞研究尚有巨大潛力有待挖掘。

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（收稿日期：2018-05-08? 本文編輯：金? ?虹）