李夢盈 姜莉苑 孫克興

[摘要] 目的 研究寧動顆粒對多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞代謝的影響。 方法 將12只18 d胎齡胎鼠隨機(jī)分為寧動顆粒組（NDG）、對照組（CTR）、氟哌啶醇組（Hal）、正常組（Normal），每組3只。將每組的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分別提取分離并培養(yǎng)，采用免疫熒光間接法對多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行酪氨酸羥化酶（TH）抗染色;采用神經(jīng)元軸突微管蛋白anti-Tau1結(jié)合FITC熒光（綠光）Ⅱ抗標(biāo)記、神經(jīng)元軸突微管蛋白anti-Tau1結(jié)合Cy 3熒光（紅光）Ⅱ抗標(biāo)記，分別對多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞及神經(jīng)元軸突進(jìn)行熒光染色鑒定，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測18 d胎齡胎鼠DA能神經(jīng)細(xì)胞在藥物干預(yù)前及干預(yù)1、6、12、24 h后多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液中單胺氧化酶（MAO）、DA、5-羥色胺（5-HT）、高香草酸（HVA）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）含量，并記錄各組DA能神經(jīng)元細(xì)胞的代謝情況。 結(jié)果 與同組0 h比較，NDG組干預(yù)6、12 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中MAO、DA、5-HT、HVA含量顯著升高（P < 0.05）;與CTR組同期比較，Hal組干預(yù)0～24 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中MAO、DA、5-HT、HVA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;干預(yù)0～24 h后，各組胎鼠培養(yǎng)液中5-HIAA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 寧動顆粒能促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元代謝，但對5-HT的代謝無顯著性影響。

[關(guān)鍵詞] 寧動顆粒;多巴胺能神經(jīng)元;5-羥色胺;遞質(zhì)代謝

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0004-04

抽動-穢語綜合征（Tourette′s syndrome，TS）是一種以無意識且重復(fù)、無目的的刻板行為為特征的慢性神經(jīng)精神性疾病，臨床表現(xiàn)主要以頭腹部及四肢不自主抽動且喉部發(fā)出奇特叫聲為特征[1]。TS屬于中醫(yī)“抽搐”“驚風(fēng)”“筋惕肉瞤”范疇[2-5]，其癥狀經(jīng)常反復(fù)、交替出現(xiàn)，時(shí)而重、時(shí)而輕，且病程較長，部分患者癥狀會持續(xù)到18歲以后，甚至有少數(shù)患者持續(xù)一生，嚴(yán)重影響患者的正常生活[6]。

TS病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全明確[7]。目前認(rèn)為TS發(fā)病與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝失衡關(guān)系最密切[8-11]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括多巴胺（DA）和5-羥色胺（5-HT）。

寧動顆粒是名中醫(yī)李安源教授的經(jīng)驗(yàn)方[12-13]。寧動顆粒能有效抑制TS模型大鼠抽動等刻板行為，同時(shí)改善多動及學(xué)習(xí)、記憶能力，其作用機(jī)制與抑制DA系統(tǒng)興奮性密切相關(guān)[14-15]。本研究擬探討寧動顆粒對體外多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞的代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥? 寧動顆粒（NDG，深圳三九中藥有限公司，批號：201603212）;氟哌啶醇（Hal，2 mg/片，上海安心八福藥業(yè)有限公司，批號：H86749384）;阿樸嗎啡（Apo，美國Sigma公司）;胰酶細(xì)胞消化液（100 ml/瓶，美國HyClone公司）;PBS緩沖液（10×，美國HydoneLaboraories公司）;胎牛血清（含雙抗，500 ml/瓶，美國Gibco公司）;DMEM培養(yǎng)基（Hyclone 31600-034，美國）;DAPI染色液、兔抗色氨酸羥化酶、神經(jīng)元軸突微管蛋白Anti-Tau1、羊抗兔熒光Ⅱ抗IgG/FITC、羊抗兔IgG/Cy 3均由美國Abcam公司生產(chǎn);DA、5-HT、單胺氧化酶（MAO）、高香草酸（HVA）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒（美國DB公司）。

1.1.2 動物? 12只18 d孕齡的Wistar大鼠由上海兒童醫(yī)學(xué)中心動物實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級，合格證號：11401500007810，體重（312.6±12.3）g，動物房室溫（23±2）℃，相對濕度45%～65%，采用12 h光照黑暗自動循環(huán)。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠多巴胺能神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)[16]? 取18 d孕齡的Wistar大鼠，脫頸處死，浸入75%的酒精消毒后，縱向剪開大鼠腹部，用無菌鑷子取出子宮，剪開胎盤及羊膜囊，取出腹中胎鼠，將所有胎鼠的頭部剪下并剖開顱骨，取出額葉前回，移到含20%葡萄糖和80%HBSS的EP管中。用0.25%胰蛋白酶孵育神經(jīng)組織30 min，再加入接種液，停止消化，將胰蛋白酶液洗去，用細(xì)口吸管將細(xì)胞懸液打碎，多次反復(fù)操作，將沉淀后的上層細(xì)胞懸液吸出，并計(jì)數(shù)預(yù)置細(xì)胞的密度，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶，再置于配好的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)液配制如下：DMEM（含葡萄糖600 mg/100 mL、NaHCO3 3.7 g/L），10%胎牛血清20 ng/mL，神經(jīng)營養(yǎng)素1 mL/100 mL，谷氨酰胺100 μg/mL。

1.2.2 細(xì)胞鑒定? 放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，取出蓋玻片，采用免疫熒光間接法對多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行酪氨酸羥化酶（TH）抗染色;采用神經(jīng)元軸突微管蛋白anti-Tau1結(jié)合FITC熒光（綠光）Ⅱ抗標(biāo)記、神經(jīng)元軸突微管蛋白anti-Tau1結(jié)合Cy 3熒光（紅光）Ⅱ抗標(biāo)記，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下成像。

1.2.3 DA、HVA、5-HT、5-HIAA、MAO濃度測定? 將上述分離的神經(jīng)元細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中，24 h后種植于24孔培養(yǎng)板，再將培養(yǎng)板置于37°C、5%CO2條件下，經(jīng)24 h后換液，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h后再換液。將培養(yǎng)板隨機(jī)等量分為寧動顆粒（NDG）組、對照（CTR）組、氟哌啶醇（Hal）組、正常（Normal）組，各組分別加15 μg/μL的NDG、Hal、Apo、生理鹽水后，在加藥干預(yù)1、6、12、24 h后，取各培養(yǎng)液上清液，采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中DA、HVA、5-HT、5-HIAA、MAO的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用q或t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定

放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，取出蓋玻片，采用免疫熒光間接法對多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行TH抗染色;采用神經(jīng)元軸突微管蛋白anti-Tau1結(jié)合FITC熒光（綠光）Ⅱ抗標(biāo)記、神經(jīng)元軸突微管蛋白anti-Tau1結(jié)合Cy 3熒光（紅光）Ⅱ抗標(biāo)記，激光掃描共聚焦熒光顯微鏡下成像。見圖1（封四）。

2.2 組間細(xì)胞培養(yǎng)液中MAO、DA、5-HT、HVA、5-HIAA含量比較

Normal組、CTR組及Hal組多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液中的MAO、DA、5-HT、5-HIAA含量在干預(yù)0～24 h后，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與同組0 h比較，NDG組胎鼠的細(xì)胞培養(yǎng)液干預(yù)6、12、24 h后的DA含量降低，而5-HT及MAO含量在干預(yù)6、12 h后升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1、圖2～3。

Hal組在藥物干預(yù)24 h內(nèi)HVA含量無明顯變化（P > 0.05）;與0 h比較，NDG組HVA含量在藥物干預(yù)6、12、24 h時(shí)顯著性升高（P < 0.01）。見表1。

3 討論

TS治療目前主要依靠西藥，其中氟哌啶醇、硫必利等精神類藥物已成為治療TS的一線藥物，西藥能抑制患兒大腦皮質(zhì)運(yùn)動區(qū)的興奮性，減輕抽動癥狀[17-19]。氟哌啶醇服用后產(chǎn)生的帕金森樣震顫、嗜睡、強(qiáng)迫性張口、反復(fù)徘徊、伸舌等不良反應(yīng)與藥物干預(yù)劑量、時(shí)間有著密切的關(guān)系，這些不良反應(yīng)使患兒及其家長無法接受和繼續(xù)治療[20-21]。

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)主要包括DA、5-HT，其中DA的神經(jīng)傳遞異常在TS病理生理學(xué)中發(fā)揮主要作用。MAO是催化單胺氧化脫氨反應(yīng)的酶，DA、5-HT在腦內(nèi)MAO作用下分別降解為HVA、5-HIAA排出體外[22-23]。

Apo的誘導(dǎo)增強(qiáng)了黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)功能[14]，從而誘導(dǎo)并增強(qiáng)了大鼠的刻板行為，故Apo可誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)TS的抽動刻板行為。NDG能對DA能系統(tǒng)代謝產(chǎn)生促進(jìn)作用，但多巴胺能神經(jīng)元系統(tǒng)體外實(shí)驗(yàn)研究尚未得到證實(shí)[15，24]。

本研究結(jié)果顯示，NDG組MAO含量在6、12 h酶的活性最高（圖2）;其細(xì)胞培養(yǎng)血清中DA含量在6、12 h明顯降低，在24 h時(shí)上升，且HVA含量在6、12 h顯著升高，在24 h時(shí)降低，提示NDG能促進(jìn)MAO的活性升高，進(jìn)而促進(jìn)DA的代謝，使DA的代謝產(chǎn)物HVA含量升高。

NDG組5-HT的含量在6、12 h顯著升高，在24 h有所下降，而代謝產(chǎn)物5-HIAA含量卻無顯著變化，提示NDG能促進(jìn)5-HT釋放，但是對5-HT代謝的影響不大。

綜上所述，MAO活性在NDG干預(yù)后6～12 h最強(qiáng)，DA含量在干預(yù)后12 h最低，HVA在干預(yù)后12 h含量最高，提示DA在寧動顆粒干預(yù)后6～12 h代謝最為旺盛。NDG能有效促進(jìn)DA能神經(jīng)元代謝，能有效調(diào)控DA代謝，但對5-HT系統(tǒng)代謝影響不大。

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（收稿日期：2018-07-16? 本文編輯：王? ?蕾）