王 勇，朱洪磊，郭潔心，馬 超，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷 030801）

應(yīng)用微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物來(lái)防治植物病害是當(dāng)前生物防治的主要發(fā)展趨勢(shì)之一[1-4]。植物內(nèi)生細(xì)菌是定殖在健康植物組織內(nèi)，并與植物建立和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、生物固氮、抗病蟲害以及增強(qiáng)寄主植物對(duì)不良環(huán)境條件的適應(yīng)能力等多種生物學(xué)作用[5-6]，尤其是內(nèi)生拮抗細(xì)菌可以產(chǎn)生脂肽、抗菌蛋白等多種物質(zhì)，是一類重要的生防資源。辛玉成[7]從蘋果果實(shí)表面分離到1株枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）XM16，通過試驗(yàn)證明，其對(duì)蘋果霉心病、枝干病害等植物真菌病害有顯著的防治效果。張文芝[8]從番茄根際土壤中分離獲得 1株蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus）AR156，該菌株對(duì)根結(jié)線蟲有很好的防治效果。邱思鑫等[9]從茄科作物體內(nèi)分離篩選出1株解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TB2，對(duì)黃瓜枯萎病菌、番茄青枯病菌和辣椒疫病菌都有較好的拮抗作用。

為了提高菌株抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，增加其防治效果，王哲等[10]采用單因素多濃度試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，對(duì)解淀粉芽孢桿菌KLBMP-033的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，其優(yōu)化后的發(fā)酵物對(duì)可可球二孢的抑菌率從53.3%提高到了83.2%。周青等[11]對(duì)解淀粉芽孢桿菌BS2004的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，青枯病菌的抑菌圈直徑達(dá)到21.75 mm，對(duì)番茄青枯的防治效果達(dá)80%，對(duì)十字花科根腫病的防效達(dá)60%，可促進(jìn)作物增產(chǎn)192%。

本研究前期從梓樹上分離到1株對(duì)番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌等多種病原菌有較好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌GZ-5，經(jīng)初步鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌。為進(jìn)一步提高其生防效果、降低發(fā)酵成本、開發(fā)其應(yīng)用價(jià)值，通過測(cè)定在不同條件下抗病促生菌的菌體生長(zhǎng)量和芽孢數(shù)優(yōu)化其發(fā)酵條件，并通過盆栽測(cè)定了GZ-5菌株的促生作用，以期為該菌株的開發(fā)及利用奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽孢桿菌GZ-5菌株為山西省植物內(nèi)生菌服務(wù)共享平臺(tái)分離純化菌種，保存于山西省綠色生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂粉 16 g，pH 值 7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，定容至 1 000 mL。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母粉5 g，葡萄糖5 g，NaCl 12 g，pH值7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH值7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 最佳碳源的篩選

1.2.1.1 種子發(fā)酵液制備 將GZ-5菌株活化后接種于NB培養(yǎng)液中，30℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)12 h獲得種子發(fā)酵液。

1.2.1.2 碳源設(shè)置 以LB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以淀粉、乳糖、果糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖等替換培養(yǎng)基中的碳源，并按照1%的接種量，分別接入GZ-5菌株種子液，于30℃條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測(cè)定各處理發(fā)酵液中的芽孢數(shù)和菌體生長(zhǎng)量。3次重復(fù)。

1.2.1.3 芽孢含量和菌體生長(zhǎng)量測(cè)定 將待測(cè)樣品置于80℃水浴鍋中水浴10 min，使未形成芽孢的菌體失活，自然冷卻后利用顯微鏡和血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行直接計(jì)數(shù)，計(jì)算芽孢量[12-13]。菌體生長(zhǎng)量用發(fā)酵液的OD600表示，采用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定[14]。

1.2.2 最佳氮源的篩選 以蛋白胨、尿素、牛肉膏＋酵母粉、牛肉膏＋酵母粉＋蛋白胨、酵母粉＋胰蛋白胨、牛肉膏＋蛋白胨和酵母粉＋蛋白胨替換培養(yǎng)基中的氮源。并于30℃條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后測(cè)定各處理發(fā)酵液中的芽孢數(shù)和菌體生長(zhǎng)量，測(cè)定方法同1.2.1。重復(fù)3次。

1.2.3 最佳發(fā)酵條件篩選 建立溫度、初始pH、接種量、裝液量4因素3水平的正交試驗(yàn)，設(shè)9種組合方式。溫度（A）分別設(shè)25，30，35℃共3個(gè)梯度；接種量（B）分別設(shè)0.1%，0.3%，0.5%共3個(gè)梯度；初始pH（C）分別設(shè)6，7，8共 3個(gè)梯度。在500 mL的三角瓶中，裝液量（D）分別裝入 100，200，300 mL發(fā)酵培養(yǎng)液3個(gè)處理。于160 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，對(duì)芽孢數(shù)和菌體生長(zhǎng)量進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 GZ-5菌株的促生作用測(cè)定 將GZ-5菌株在最佳培養(yǎng)條件下發(fā)酵培養(yǎng)48 h獲得菌株發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min，4℃離心10 min，分別獲得上清液和細(xì)菌菌體，并將菌體加入到與發(fā)酵液等體積的無(wú)菌水中，制成菌懸液。上清液和菌懸液分別稀釋一定的倍數(shù)后備用。選取大小長(zhǎng)勢(shì)基本一致的2～3葉期的番茄幼苗作為試驗(yàn)對(duì)象，分別澆灌原液、5倍、10倍、50倍、100倍的稀釋液，放置人工氣候箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度25℃，濕度為70%，光照時(shí)間每天16 h），20 d后測(cè)定各處理番茄苗的株高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量。重復(fù)3次。同時(shí)以營(yíng)養(yǎng)液和無(wú)菌水為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳碳源篩選結(jié)果

GZ-5菌株經(jīng)發(fā)酵48 h后，菌體生長(zhǎng)量及芽孢量如圖1所示。從圖1可以看出，最適合GZ-5菌株生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖，其OD600可達(dá)2.03，其次為蔗糖、果糖，而淀粉、乳糖、麥芽糖較低；最適合GZ-5菌株產(chǎn)芽孢的碳源為葡萄糖，芽孢生成量為3.87×109cfu/mL，其次為蔗糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、果糖。因此，選擇葡萄糖為促進(jìn)GZ-5菌株生長(zhǎng)的最佳碳源。

2.2 最佳氮源篩選結(jié)果

以葡萄糖為碳源篩選適合GZ-5菌株生長(zhǎng)的最佳氮源，篩選結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，GZ-5菌株在含有不同氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)量和生成的芽孢量不同，其中，最適合菌株生長(zhǎng)的氮源為牛肉膏+蛋白胨，發(fā)酵48 h，其發(fā)酵液OD600為1.95，其次為蛋白胨＋酵母粉、牛肉膏＋蛋白胨＋酵母粉；而芽孢生成量最多的為牛肉膏＋蛋白胨＋酵母粉，發(fā)酵48 h，其發(fā)酵液中芽孢量為3.18×109cfu/mL。因此，選擇牛肉膏+蛋白胨+酵母粉為GZ-5菌株的最適氮源。

2.3 最佳發(fā)酵條件篩選結(jié)果

菌體生長(zhǎng)量及芽孢量最適發(fā)酵條件測(cè)定結(jié)果如表1所示。方差分析結(jié)果表明（圖3），在不考慮各因素之間的交互作用時(shí)最優(yōu)組合是A2B2C3D1或A2B3C1D2（表1）；在考慮有關(guān)因素的交互作用時(shí)，通過正交試驗(yàn)方差分析可以得出，以芽孢量為基準(zhǔn)的最優(yōu)組合為A2B2C2D2（圖3，表2）。由方差分析結(jié)果可知，最佳發(fā)酵條件是：溫度30℃、接種量0.3%、初始pH7.0、裝液量為500mL三角瓶中裝入200mL。

表1 內(nèi)生細(xì)菌GZ-5發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 最優(yōu)組合結(jié)果

2.4 GZ-5菌株促生作用測(cè)定結(jié)果

促生測(cè)定結(jié)果表明，GZ-5菌株發(fā)酵液及菌懸液均對(duì)番茄幼苗的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的促生作用。從圖4可以看出，GZ-5菌株的發(fā)酵液10倍稀釋液處理番茄幼苗20 d后，其株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別比對(duì)照增加了37.48%，19.98%，35%，且達(dá)到了顯著水平，其他處理除發(fā)酵原液表現(xiàn)出一定的抑制作用外，均表現(xiàn)出促生。而從圖5可以看出，GZ-5菌株的菌懸液原液處理番茄幼苗20 d后，其株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量分別比對(duì)照增加了49.17%，49.45%，49.44%，且達(dá)到了顯著水平，其他處理也均表現(xiàn)出促生作用。

3 結(jié)論與討論

拮抗菌或其他生防菌發(fā)酵條件的優(yōu)化是菌株投入生產(chǎn)應(yīng)用的先決條件，碳源、氮源、溫度、pH、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等都會(huì)影響到芽孢桿菌的生物量及芽孢數(shù)量。車曉曦等[15]研究結(jié)果表明，解淀粉芽孢桿菌SAB-1的最佳發(fā)酵條件為：溫度31℃，初始pH 6.0，接種量1%，250 mL三角瓶中裝液量50 mL，180 r/min、發(fā)酵培養(yǎng)26 h。權(quán)春善等[16]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌Q-12的最佳發(fā)酵條件為溫度33℃、初始pH 6.0、最佳培養(yǎng)時(shí)間為40 h。信珊珊等[17]研究得出，解淀粉芽孢桿菌WH1的最佳發(fā)酵條件以溶氧量在30%以上、時(shí)間為48 h最佳。本研究結(jié)果表明，菌株GZ-5的最佳碳源為葡萄糖，最佳氮源是牛肉膏＋酵母粉＋蛋白胨，最適發(fā)酵條件為溫度30℃、初始pH 7.0、接種量0.3%、裝液量為500 mL三角瓶中裝入200 mL，在此條件下，發(fā)酵培養(yǎng)48 h左右，菌體生物量及芽孢生成量均達(dá)到最佳。這與高振峰[18]的研究結(jié)果類似。

IDRISS等[19]通過試驗(yàn)表明，解淀粉芽孢桿菌可通過分泌生長(zhǎng)素類似物（IAA）來(lái)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。宋永燕等[20]研究LM-3對(duì)水稻的促生作用時(shí)也發(fā)現(xiàn)，低濃度拮抗菌對(duì)植物有促生作用，但較高濃度處理卻出現(xiàn)抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GZ-5發(fā)酵液的不同稀釋倍數(shù)對(duì)番茄幼苗均表現(xiàn)出先增大后下降的趨勢(shì)，10倍稀釋液對(duì)番茄幼苗的生長(zhǎng)最好。這與李哲[21]在小麥上的解淀粉芽孢桿菌FZB42的促生試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)僅通過室內(nèi)盆栽測(cè)定了GZ-5菌株的促生作用，但對(duì)于該菌株的田間促生效果和促生機(jī)制等還有待于進(jìn)一步的研究。