耿文靜 李文婷 史 偉 黑明燕

自耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)出現(xiàn)以來(lái)，社區(qū)獲得性MRSA(CA-MRSA)感染的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì), 由于其毒力及致病力強(qiáng)，感染率持續(xù)升高[1]，目前已經(jīng)成為WHO重點(diǎn)關(guān)注的對(duì)象。CA-MRSA常引起皮膚或軟組織感染，主要病變包括膿皰瘡、膿腫等，新生兒因其免疫力低下，細(xì)菌定植率高，皮膚屏障功能差, 是CA-MRSA感染的高危人群[2,3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于新生兒CA-MRSA皮膚軟組織感染的報(bào)道仍較少。本文前瞻性收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院(我院)CA-MRSA菌株，行分子分型、耐藥性及毒力基因等的檢測(cè)，為臨床預(yù)防和治療新生兒CA-MRSA提供依據(jù)。

1 方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) ①新生兒皮膚軟組織感染主要包括: 結(jié)膜炎、蜂窩織炎、膿皰瘡、膿腫、皮膚外傷和術(shù)后傷口分泌物等，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《實(shí)用新生兒學(xué)》(第4 版)[4]。②CA-MRSA診斷標(biāo)準(zhǔn)：在門(mén)診或入院48 h內(nèi)感染分離的菌株，并且此前1年內(nèi)無(wú)住院、透析、手術(shù)、使用各種導(dǎo)管和其他穿過(guò)皮膚的醫(yī)用裝置史[5]。

1.2 菌株來(lái)源 我院NICU臨床診斷為新生兒皮膚軟組織感染并符合CA-MRSA診斷標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)病例，采集皮膚軟組織標(biāo)本，患兒家長(zhǎng)簽署行CA-MRSA菌株的基因檢測(cè)知情同意書(shū)。皮膚軟組織標(biāo)本通過(guò)菌落的形態(tài)學(xué)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，凝固酶試驗(yàn)和頭孢西丁紙片(30 Pg，Oxoid)法對(duì)其進(jìn)行篩查。-20℃貯藏，本院冷鏈運(yùn)送至北京市兒科研究所皮膚疾病研究室，使用PCR方法檢測(cè)mecA和nuc基因。

1.3 CA-MRSA菌株的基因檢測(cè)

1.3.1 CA-MRSA菌株分子DNA的提取 硅膠模型TM基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；溶葡萄球菌素(1 200 U·mL-1)購(gòu)自BBI 公司。所提DNA作為所有PCR的模板。

1.3.2 MLST分型 使用PCR檢測(cè)7個(gè)看家基因：arcC、aroE、glpF、gmk、pta、tpi和yqil。參考Enright等[6]設(shè)計(jì)的引物，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，然后94℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增后的目的片段測(cè)序由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司完成。測(cè)序結(jié)果在MLST數(shù)據(jù)網(wǎng)站(http://saureus.mlst.net)上比對(duì)等位基因的序列型(ST)。應(yīng)用eBURSTv3 軟件進(jìn)行菌株親緣關(guān)系分析。

1.3.3 SCCmec分型 多重PCR[7]對(duì)所有的分離株進(jìn)行SCCmec分型及亞型檢測(cè)。SCCmecⅠ-Ⅴ型標(biāo)準(zhǔn)株由日本順天堂大學(xué)Teruyo Ito教授贈(zèng)送。

1.3.4 spa分型 引物5’-GACGATCCTFCAGTGAGCAAAG-3’(上游)，5’-GCAGCAATTTTGTCAGCAGTAG-3’(下游)。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增后的目的片段測(cè)序由北京天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，測(cè)序結(jié)果通過(guò)spa分型數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www. ridom.de/spaserver)進(jìn)行分型。

1.3.5PVL基因檢測(cè) 其中上游引物設(shè)計(jì)：5’-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATG-3’，下游引物設(shè)計(jì)：5'-GCATCAASTGTATTGGATAG CAAAAGC-3’。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min，然后94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min 。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度433 bp。PCR產(chǎn)物在含溴乙啶的1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察和保存結(jié)果。

1.3.6 超抗原毒素基因檢測(cè)及agr分型的測(cè)定 通過(guò)6個(gè)多重PCR反應(yīng)[8]對(duì)每株SA進(jìn)行21種超抗原毒素基因檢測(cè)及agr分型測(cè)定：①sea、seh、sec和tst；②sed、etd、eta和sek；③see、seb、sem、sel和seo；④sen、seg、seq和sej；⑤sei、ser、seu和sep；⑥agr-1至agr-4。用PTC-200PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ Research公司)進(jìn)行PCR操作。每個(gè)PCR擴(kuò)增體系(25 μL) 包含10×PCR buffer(Mg2+Plus)2.5 μL，2.5 mmol dNTP混合物1.5 μL，10 μmol·μL-1引物各1 μL，5 U·μL-1TaKaRa Taq 0.2 μL，模板DNA 2.5 μL。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在含溴乙啶的1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察和保存結(jié)果。以超抗原基因陽(yáng)性的SA標(biāo)準(zhǔn)株作為陽(yáng)性對(duì)照，SA 8325-4作為超抗原基因陰性對(duì)照。德國(guó)Greifswald大學(xué)Br?ker教授饋贈(zèng)了所有對(duì)照菌株。

1.3.7SasX基因檢測(cè) 引物參照2010年對(duì)ST239測(cè)序完成并公布的SATW20_21850序列進(jìn)行設(shè)計(jì)[9]。上游引物設(shè)計(jì)：5’-AGAATTAGAAGTACGTCTAAATGC-3’,下游引物設(shè)計(jì)：5'-GCTGATTATGTAAATGACTC AAATG-3’。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min 。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度522 bp。PCR產(chǎn)物在含溴乙啶的1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，用凝膠成像儀觀察和保存結(jié)果。

1.4 體外藥物敏感試驗(yàn) 根據(jù)2016年美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)[10]，采用瓊脂稀釋法檢測(cè)所有菌株對(duì)青霉素、苯唑西林、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺、替吉環(huán)素、夫西地酸、頭孢呋辛、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素、環(huán)丙沙星、利福平、莫匹羅星的敏感性，ATCC29213 為質(zhì)控菌株，根據(jù)所測(cè)菌的最小抑菌濃度( MIC)，計(jì)算MIC50 及MIC 范圍。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，兩兩比較行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2016年1月1日至2017年12月31日我院NICU臨床診斷為新生兒皮膚軟組織感染的連續(xù)病例60例，28例感染標(biāo)本中檢測(cè)出CA-MRSA菌株，其中2例分別在同一患兒的2個(gè)感染部位各培養(yǎng)出1株CA-MRSA菌株， 30株CA-MRSA進(jìn)入本文分析。

28例CA-MRSA皮膚軟組織感染的新生兒，中位日齡10 (0～21) d，其中早期新生兒17例，晚期新生兒11例；女17例，男11例；均為足月兒；除1例出生體重2 940 g外，余出生體重均>3 000 g；剖宮產(chǎn)13例，自然分娩15例，5例在入院前出現(xiàn)發(fā)熱，入院后經(jīng)靜脈及局部抗生素治療后好轉(zhuǎn)，28例患兒均痊愈出院。

2.2 臨床特征 單部位感染10例，多部位感染18例。30株CA-MRSA中，分離自臍部蜂窩織炎12株(40.0%)，膿皰瘡和膿腫各7株(23.3%)，結(jié)膜炎2株(6.7%)，分離自肺炎合并臍部蜂窩織炎的痰液標(biāo)本1株(3.3%)，肺炎合并膿皰瘡的痰液標(biāo)本1株(3.3%)。12例臍部蜂窩織炎中5例未合并全身性感染，3例合并肺炎，2例合并敗血癥，1例同時(shí)合并化膿性腦膜炎及敗血癥，1例同時(shí)合并化膿性腦膜炎和泌尿系統(tǒng)感染。7例膿皰瘡中3例未合并全身感染，2例合并肺炎，1例同時(shí)合并敗血癥和肺炎，1例同時(shí)合并化膿性腦膜炎和肺炎。7例膿腫患兒中1例未合并全身感染，2例同時(shí)合并敗血癥和化膿性腦膜炎，1例合并闌尾炎，1例合并腹瀉病，1例合并敗血癥和血小板減少癥，此外1例合并肝功能損害。2例結(jié)膜炎患兒中，1例未合并全身感染，1例合并敗血癥。

2.3 CA-MRSA皮膚軟組織感染菌株的分子特點(diǎn) 30株CA-MRSA的MLST分型有4種，以ST59為主(27株，90.0%)，其他3株分別為ST398、ST22和ST630；spa型有6種，分別為t437(23株，76.7%)、t1751(2株)、t3523(2株)、t309(1株)、t034(1株)、t4549(1株)。30株CA-MRSA均可明確SCCmec分型，分別為SCCmecⅣ(26株，86.7%)、Ⅴ(3株)和 Ⅲ(1株)型，其中SCCmecⅣ型全部為Ⅳa亞型。所有的MRSA菌株均為agr-1型，綜合上述基因分型，MRSA最常見(jiàn)的流行克隆為ST59-Ⅳa-t437-agr-1(73.3%，22/30)。表1顯示感染部位與菌株分子分型的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

2.4 CA-MRSA皮膚軟組織感染菌株的毒力基因檢測(cè)結(jié)果 MRSA菌株超抗原基因攜帶率為80%(24/30)，主要的毒力基因分別是seq(67%，20/30)、seb(57% ，17/30)和sek(47%， 14/30)，最常見(jiàn)的超抗原基因譜為seb-sek-seq(70%，21/30)。單部位感染與多部位感染新生兒超抗原基因的攜帶率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(70%vs85%，P=0.96)。

PVL的陽(yáng)性率為47%(14/30),14例均合并有多部位的感染，所有分離株均未檢測(cè)到sasX基因。

2.5 抗生素敏感性 表2顯示，本研究檢測(cè)了30株CA-MRSA對(duì)14種抗菌藥物的敏感性，對(duì)青霉素均耐藥；對(duì)苯唑西林耐藥率為60%，中介率27%；對(duì)頭孢曲松的耐藥率為77%，中介率17%；MRSA對(duì)紅霉素耐藥率為93%，對(duì)夫西地酸耐藥率3.3%，對(duì)其他抗菌藥物包括慶大霉素、利福平、磺胺甲噁唑-甲氧芐啶、莫匹羅星、左氧氟沙星、美羅培南、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺及替加環(huán)素均敏感。

表3顯示，在30株MRSA中共檢測(cè)出4株(13%)苯唑西林敏感的MRSA(OS-MRSA)，ST59-IVa-t437-agr1 (3/4)為最常見(jiàn)的流行克隆，4株對(duì)青霉素和頭孢曲松均耐藥， 3株OS-MRSA對(duì)紅霉素耐藥，1株對(duì)紅霉素中介，對(duì)其余抗菌藥物均敏感。

表1 CA-MRSA菌株的ST分型與臨床疾病譜的分布

表2 CA-MRSA菌株藥物敏感性檢測(cè)結(jié)果[n(%)]

注 MIC:最低抑菌濃度,單位mg·L-1；MIC50/MIC90：半數(shù)抑菌濃度/90%抑菌濃度；TMP-SMX ：磺胺甲噁唑-甲氧芐啶

表3 OS-MRSA分子特征與藥敏結(jié)果

3 討論

金黃色葡萄球菌引起的社區(qū)和院內(nèi)的感染是世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重問(wèn)題，<1歲的嬰兒中皮膚軟組織感染是MRSA引起的最主要的感染[11]， 2003至2008年一項(xiàng)兒童急診中皮膚軟組織感染的回顧性研究顯示，CA-MRSA的分離率從21%上升到42%[12], 而新生兒因免疫系統(tǒng)薄弱，MRSA定植率高，更易引發(fā)感染，美國(guó)CDC也報(bào)道了MRSA所致的皮膚軟組織感染在新生兒中的廣泛流行[13]。

世界范圍內(nèi)許多國(guó)家和地區(qū)兒童感染性MRSA最主要的SPA分型為t1610、t008、t149和t024, 日本對(duì)全國(guó)范圍內(nèi)的CA-MRSA皮膚軟組織感染的研究發(fā)現(xiàn)，CA-MRSA的最主要分型為ST8-SCCmecⅣc[14,15]。2016年有研究報(bào)道中國(guó)兒童及成人皮膚軟組織感染CA-MRSA最主要的分型為ST121-SCCmecⅣ-t437[16]。本研究中新生兒皮膚軟組織感染CA-MRSA最主要的分型為ST59-SCCmecⅣa-t437，與上述報(bào)道明顯不同，但與Li等報(bào)道中國(guó)兒童CA-MRSA的主要分型一致[17]。ST398為世界范圍內(nèi)豬及豬飼養(yǎng)員定植及感染的主要克隆株，以往已有報(bào)道該克隆所導(dǎo)致成人的皮膚軟組織感染[18]，本研究首次在新生兒結(jié)膜炎的分泌物中發(fā)現(xiàn)了ST398克隆的菌株，因此該克隆所引起的人畜傳播及導(dǎo)致的感染性疾病需引起強(qiáng)烈的重視。

sasX毒力基因是MRSA定植及致病的主要毒力基因，易導(dǎo)致侵襲性感染，且多為ST239克隆攜帶，已在世界范圍內(nèi)廣泛流行[19]，本研究檢測(cè)了但未發(fā)現(xiàn)sasX基因，可能與主要的克隆為ST59、未發(fā)現(xiàn)ST239有關(guān)。本研究中CA-MRSA的超抗原毒力基因及PVL基因攜帶率仍較高，與既往的報(bào)道一致[20]，值得注意的是，PVL陽(yáng)性菌株所致的新生兒皮膚軟組織感染均合并有多部位的感染，而本研究中超抗原毒力基因的攜帶與是否合并有其他部位的感染，無(wú)明顯相關(guān)性，因此仍認(rèn)為PVL在新生兒皮膚軟組織感染者中發(fā)揮著重要作用，因本研究標(biāo)本量少，超抗原毒力基因在皮膚軟組織感染中所起的作用，仍需進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)CA-MRSA菌株對(duì)紅霉素的耐藥率為93%，僅次于青霉素的耐藥率，但對(duì)其他常用抗菌藥物如莫匹羅星、美羅培南、萬(wàn)古霉素、利奈唑胺均敏感。值得注意的是，本研究首次報(bào)道了新生兒中OS-MRSA，已有研究表明OS-MRSA與世界范圍內(nèi)動(dòng)物和人的感染相關(guān)，本研究顯示ST59-SCCmecⅣ-t437 是OS-MRSA最主要的克隆，這與國(guó)內(nèi)的研究報(bào)道OS-MRSA主要的克隆為 ST338-t437-SCCmecⅤ (32%) 和ST59-t437-SCCmecⅣ/Ⅴ (21%) 相似[21]，但與其他國(guó)家和地區(qū)明顯不同，非洲OS-MRSA的主要克隆為ST88和ST8，而巴西的OS-MRSA克隆更為多樣化[22,23]，其克隆的基因環(huán)境與OS-MRSA的相關(guān)性仍有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。有研究表明，金葡菌細(xì)胞壁 Fem 蛋白的氨基酸突變可能與 OS-MRSA菌株苯唑西林的敏感性有關(guān)[24], OS-MRSA在傳統(tǒng)的藥敏實(shí)驗(yàn)中更容易被誤診為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，從而可能延誤診斷和治療，因此對(duì)此類(lèi)菌株的出現(xiàn)及流行要引起極大的重視。

本研究闡明了新生兒皮膚軟組織感染CA-MRSA菌株的主要分子分型及毒力特征，為未來(lái)臨床檢驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)快速分子分型及針對(duì)性的預(yù)防、隔離及治療，提供了理論依據(jù)。但所有病例均來(lái)自于我院，且樣本量少，有一定的局限性，未來(lái)可進(jìn)行國(guó)內(nèi)多中心的相關(guān)研究，從而進(jìn)一步明確中國(guó)新生兒皮膚軟組織感染的病原菌特點(diǎn)，為進(jìn)一步防控提供更全面的理論依據(jù)。