王琳 唐海玲 胡志坤

[摘要]目的：分析硬皮病、瘢痕疙瘩與硬化萎縮性苔蘚患者LIGHT及其受體LTβR、HVEM病理生理學(xué)意義的差異性。方法：選取2015年4月-2018年4月在筆者醫(yī)院接受治療并確診為瘢痕疙瘩、硬化萎縮性苔蘚和硬皮病的患者標本共60例，其中瘢痕疙瘩19例，硬皮病21例，硬化萎縮性苔蘚20例，選取同期在筆者醫(yī)院行整形手術(shù)的正常皮膚標本20例，免疫組化檢測硬化萎縮性苔蘚、瘢痕疙瘩、硬皮病及正常皮膚組織內(nèi)LIGHT及其受體HVEM、LTβR表達狀況。結(jié)果：正常皮膚組織真皮中能夠看到微量表達的HVEM、LTβR，LIGHT在病變中是陰性;硬化萎縮性苔蘚、瘢痕疙瘩及硬皮病患者真皮內(nèi)均可看到LIGHT與其受體HVEM、LTβR蛋白表達，其主要表達于炎性細胞、成纖維細胞與血管內(nèi)皮細胞包膜上，細胞膜為棕黃色或黃色;硬化萎縮性苔蘚組、瘢痕疙瘩組及硬皮病組患者皮膚組織內(nèi)HVEM、LTβR和LIGHT光密度值均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：硬化萎縮性苔蘚、瘢痕疙瘩及硬皮病起病與進展中可能有LIGHT及其受體HVEM、LTβR參與，但具體路徑和參與形式仍需進一步探究。

[關(guān)鍵詞]硬化萎縮性苔蘚;瘢痕疙瘩;硬皮病;LIGHT;受體LTβR;受體HVEM

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2019）02-0080-03

Abstract： Objective? To analyze the difference of pathophysiological significance between LIGHT and its receptor LTβR and HVEM in patients with scleroderma， keloid and sclerosing atrophic moss. Methods? A total of 60 patients with keloids， sclerosing atrophic moss and scleroderma were enrolled in our hospital from April 2015 to April 2018， including 19 patients with keloid specimens and scleroderma specimens. Twenty-one patients with sclerosing atrophic moss specimens were enrolled in the study. Twenty patients with normal skin specimens underwent plastic surgery in the same period. Immunohistochemistry was used to detect LIGHT and its receptors in cirrhotic atrophic moss， keloid， scleroderma and normal skin tissues. HVEM， LTβR expression status. Results? HVEM and LTβR， LIGHT were negative in normal skin tissue dermis， and LIGHT and its receptor HVEM and LTβR protein expression were observed in dermis of patients with sclerosing atrophic moss， keloid and scleroderma. It is mainly expressed on the envelope of inflammatory cells， fibroblasts and vascular endothelial cells， and the cell membrane is brownish yellow or yellow; HVEM， LTβR and LIGHT optical density in the skin tissue of patients with sclerotic atrophic moss， keloid group and scleroderma group The values were higher than the normal group（P<0.05）. Conclusion? LIGHT and its receptors HVEM and LTβR may be involved in the onset and progression of cirrhotic atrophic moss， keloid and scleroderma， but the specific path and form of participation still need to be further explored.

Key words： sclerosing atrophic moss; keloid; scleroderma; LIGHT; receptor LTβR; receptor HVEM

硬皮病為臨床多見的一種結(jié)締組織疾病，主要特征為內(nèi)臟和皮膚纖維化，患者發(fā)病機制包含多因素，而感染和自身免疫等因素在硬皮病的發(fā)生和進展中有重要作用。硬化萎縮性苔蘚為炎癥性慢性疾病，可導(dǎo)致內(nèi)臟或皮膚出現(xiàn)硬化與纖維化，自身免疫等因素與患者的發(fā)病有一定聯(lián)系[1-2]。瘢痕疙瘩為膠原纖維異常聚集所導(dǎo)致的瘢痕疾病，其發(fā)病因素和細胞凋亡失調(diào)、傷口張力及遺傳等因素有關(guān)，膠原和成纖維細胞異常沉積在瘢痕疙瘩形成中有重要作用。LIGHT為腫瘤壞死因子超家族內(nèi)主要成員，還可稱為TNFSF14，為淋巴毒素類似物。LIGHT及受體LTβR、HVEM在臨床多種疾病內(nèi)有重要生物學(xué)影響，特別是自身免疫性疾病。LIGHT可參加組織重塑與纖維化，與結(jié)構(gòu)或炎癥細胞內(nèi)受體相互影響而參加部分促纖維因子表達，并加速膠原等細胞外基質(zhì)蛋白沉積[3-4]。在臨床上，如瘢痕疙瘩、硬化萎縮性苔蘚和硬皮病等一些結(jié)締組織增殖或皮膚纖維化等疾病，是否與LIGHT及受體LTβR、HVEM有關(guān)，目前相關(guān)研究較少。因此，本研究經(jīng)過分析硬皮病、瘢痕疙瘩及硬化萎縮性苔蘚患者LIGHT及其受體LTβR和HVEM病理生理學(xué)差異性，為臨床診療提供思路。

1? 材料和方法

1.1 病例資料：選取2015年4月-2018年4月于筆者醫(yī)院接受治療并確診為瘢痕疙瘩、硬化萎縮性苔蘚和硬皮病患者的組織標本共60例，排除合并其他慢性系統(tǒng)性或皮膚疾病者。其中瘢痕疙瘩標本19例，年齡25～66歲，平均（42.18±6.31）歲，男10例，女9例;硬化萎縮性苔蘚標本20例，年齡22～68歲，平均（43.61±6.83）歲，男11例，女9例;硬皮病標本21例，年齡24～64歲，平均（41.65±6.50）歲，男10例，女11例。選取同期在筆者醫(yī)院行整形手術(shù)的正常皮膚標本20例，年齡在20～55歲，平均（39.28±6.21）歲，四組對象臨床資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬知情并簽署同意書。

1.2 試驗試劑與儀器：試劑：無水乙醇、脫蠟透明劑、中性樹膠（購自上海國藥公司），鼠抗LIGHT單克隆抗體、兔抗HVEM多克隆抗體及兔抗LTβR多克隆抗體（美國Abcam公司），檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS緩沖液（邁新生物技術(shù)公司），蘇木素、DAB試劑盒（邁新生物公司）。儀器：烘片機（龍首電子儀器公司），電熱恒溫水浴箱（德國Eplpendorf公司），轉(zhuǎn)輪式切片機（型號：萊卡-2016，德國萊卡公司），低溫冰箱（德國Ultra-low公司），推片機（龍首電子儀器公司），蒸汽高壓消毒箱（德國Tuttnauer公司），圖像分析儀（美國Metarnprph Image System V4.6VIC），光學(xué)顯微鏡（日本OlyrnpusCH-2），微量移液器（德國Eplpendorf公司）。

1.3 研究方法：①脫蠟及水洗，在60℃烤箱內(nèi)將石蠟切片烘烤1h，切片取出后在脫蠟透明劑Ⅰ內(nèi)浸泡15min，在脫蠟透明劑Ⅱ內(nèi)浸泡15min，切片于梯度酒精內(nèi)浸泡，采用PBS溶液沖洗3次，1次/5min;②檸檬酸鹽抗原修復(fù)液倒入器皿內(nèi)，置入切片，高壓鍋冒氣后計時1.5min，容器取出后冷卻，PBS溶液沖洗3次，1次/5min;③加入3% H2O2的去離子水50ml，放置10min，PBS溶液沖洗3次，1次/5min;④將山羊血清封閉液50ml滴入切片組織上，室溫下放置30min;⑤多余封閉液甩去，滴入Ⅰ抗50ml，切片放入濕盒內(nèi)，在4℃下過夜;⑥14h后將濕盒取出，置入37℃的水浴鍋內(nèi)，PBS溶液清洗3次，1次/5min;⑦加入50ml Ⅱ抗，孵育10min后使用PBS溶液沖洗3次，1次/5min;⑧切片內(nèi)滴加50ml的辣根酶標記鏈霉卵白素液，室溫下靜置8min，PBS溶液沖洗3次，1次/5min;⑨行DAB染色，顯微鏡下觀察其顯色狀況，放置蒸餾水內(nèi)顯色中止;⑩切片取出后擦干，滴入50ml蘇木素復(fù)染色，自來水沖洗，鹽酸-乙醇分化，梯度酒精后置入二甲苯內(nèi)透明，中性樹膠封片。組織細胞膜經(jīng)過染色后，表征為棕黃色或黃色判定陽性。正常和各組患者皮膚組織內(nèi)LIGHT及其受體表達狀況采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析，一個切片隨機選取5個視野，檢測表皮下積分的光密度數(shù)值和皮下面積，計算平均光密度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料（x?±s）表示，行t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 各組患者免疫組化檢測結(jié)果：在正常皮膚組織真皮中，可看到微量表達的HVEM、LTβR，LIGHT是陰性。硬皮病患者真皮內(nèi)均可看到LIGHT及其受體HVEM、LTβR蛋白表達，主要表達于炎性細胞、成纖維細胞與血管內(nèi)皮細胞包膜上，細胞膜為棕黃色或黃色;瘢痕疙瘩患者真皮內(nèi)均可看到LIGHT及其受體HVEM、LTβR蛋白表達，主要表達于炎性細胞、成纖維細胞與血管內(nèi)皮細胞包膜上，細胞膜為棕黃色或黃色;硬化萎縮性苔蘚患者真皮內(nèi)均可看到LIGHT及其受體HVEM、LTβR蛋白表達，主要表達于炎性細胞、成纖維細胞與血管內(nèi)皮細胞包膜上，細胞膜為棕黃色或黃色。

2.2 各組患者皮膚組織內(nèi)HVEM、LTβR和LIGHT光密度值：硬化萎縮性苔蘚組、瘢痕疙瘩組及硬皮病組患者皮膚組織內(nèi)HVEM、LTβR和LIGHT光密度值均高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

3? 討論

硬皮病為結(jié)締組織疾病，臨床可分成系統(tǒng)性與局限性硬皮病，關(guān)于其病因目前尚未完全明確，有多重信號通路、細胞因子等參與，可能與自身免疫、遺傳、病毒感染、創(chuàng)傷及藥物等有關(guān)[5-6]。有研究顯示硬皮病患者發(fā)病中，TGF-β信號路徑可對纖維細胞起刺激作用而形成大量膠原蛋白，并最終生成纖維化[7-8]。硬化萎縮性苔蘚為慢性炎癥性疾病，能夠?qū)е聝?nèi)臟或者皮膚出現(xiàn)硬化與纖維化，并進展萎縮。LIGHT能夠結(jié)合其受體DcR3、HVEM及LTβR而起到不同生物學(xué)效應(yīng)，如腫瘤與多種自身免疫系統(tǒng)疾病的出現(xiàn)與進展中都有LIGHT及其受體的參與，LIGHT可結(jié)合其受體參加TSLP、TGF-β等加速纖維化因子表達，從而起到重塑與加速纖維化作用。LIGHT可刺激角質(zhì)而產(chǎn)生細胞，同時可發(fā)現(xiàn)有高表達的TSLP，最后導(dǎo)致皮膚進展為特應(yīng)性皮炎樣或硬皮病特征[9-12]。

本研究顯示正常皮膚內(nèi)受體HVEM、LTβR為弱陽性表達，LIGHT則為陰性表達，說明在硬化萎縮性苔蘚、瘢痕疙瘩、硬皮病發(fā)病中可能有LIGHT及其受體參與。不同疾病中LIGHT所起的影響有顯著性差異，這主要與LIGHT受體在不同疾病狀況下的表達有差異相關(guān)。相關(guān)研究顯示，正常人牙齦的成纖維細胞內(nèi)LIGHT沒有表達，但在牙齦疾病患者成纖維細胞內(nèi)可檢測LIGHT高表達，由此可推測，出現(xiàn)疾病可能與牙齦成纖維細胞內(nèi)LIGHT表達有關(guān)[13-14]。皮膚T細胞淋巴瘤（CTCL）的進展和LIGHT表達有聯(lián)系，伴隨患者疾病進展，陽性表達的LIGHT淋巴細胞數(shù)量變多，HVEM則能夠在血液腫瘤細胞或者皮損真皮成纖維細胞內(nèi)表達。前期CTCL的皮損成纖維細胞內(nèi)HVEM為高表達，晚期CTCL患者成纖維細胞內(nèi)表達下降，但LTβR的含量卻無顯著改變[15-16]。本研究對LIGHT及其受體表達進行了橫向?qū)Ρ?，結(jié)果顯示，硬化萎縮性苔蘚患者其皮膚組織內(nèi)LIGHT蛋白的表達量最高，而在瘢痕疙瘩患者內(nèi)最低;硬化萎縮性苔蘚者其皮膚組織內(nèi)HVEM蛋白表達量最高，而在硬皮病患者內(nèi)最低;瘢痕疙瘩者皮膚組織內(nèi)LTβR蛋白表達量最高，而在硬化萎縮性苔蘚患者最低。由此可知上述三種疾病中LIGHT及其受體表達含量有一定的差異，可能與疾病進展階段不同或疾病種類不同有關(guān)。

綜上所述，硬化萎縮性苔蘚、瘢痕疙瘩及硬皮病起病與進展中可能有LIGHT及其受體HVEM、LTβR參與，但其具體路徑和參與形式仍需更進一步探究。

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