鄧貴福

(1 重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121；2 重慶市藥物過程與質量控制工程技術研究中心，重慶 401121；3 重慶市化學藥品質量控制與評價協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶 401121)

頭孢呋辛(cefuroxime)是英國葛蘭素公司于1974年研究開發(fā)的第二代頭孢菌素類抗生素，抗菌活性強，臨床用于敏感的致病菌引起呼吸道感染、耳鼻喉感染、泌尿系統(tǒng)感染、敗血癥、腦膜炎、骨和關節(jié)感染、皮膚軟組織感染、腹腔感染、生殖系統(tǒng)感染包括淋病，也可用于術前預防感染[1]。不良反應較少見，多表現為輕度過敏反應和消化道癥狀等[2]。上市劑型主要為粉針劑，美國有粉液雙室袋產品上市。

頭孢菌素一般由微生物發(fā)酵、純化、精制以及化學修飾等過程制得，可能含有的雜質情況較常規(guī)化學合成藥品更為復雜[3]。此外，頭孢菌素結構不穩(wěn)定，在生產及儲存過程中遇光、熱、水等條件均會發(fā)生降解反應，形成一系列的降解物及聚合物[4]，使其失去抗菌活性，甚至產生毒副反應。因此，對藥品的雜質譜進行研究，明確雜質結構和產生機理，對改進生產工藝，優(yōu)化儲存條件，提高產品質量具有重要意義。

中國藥典2015年版已收載頭孢呋辛鈉原料及注射用頭孢呋辛鈉，頭孢呋辛鈉原料藥還收載于美國藥典40版、英國藥典2017版及歐洲藥典8.0版。其中美國藥典40版未對有關物質進行控制，中國藥典僅控制了單個雜質和總雜質[5]，未對頭孢呋辛鈉的特定雜質(工藝或降解雜質)進行針對性的控制；歐洲藥典8.0版提供了9個雜質的結構，并規(guī)定去氨甲酰頭孢呋辛的含量不得過1.0%，還規(guī)定了單個雜質和總雜質的限度[6]。

本研究對中國藥典和歐洲藥典收載的有關物質進行了對比研究，結果顯示，中國藥典方法檢出的雜質個數更多，雜質含量更高，且由于采用的梯度洗脫方式，各雜質的分布較均勻，分離度更好。后續(xù)研究均采用中國藥典方法對注射用頭孢呋辛鈉的有關物質進行研究，并采用多個已知雜質進行了方法學驗證。

本研究對國內兩個廠家的注射用頭孢呋辛鈉和原研品“西力欣”的雜質譜進行了對比分析，并對檢出的主要雜質進行了結構解析和來源分析，為完善藥品質量標準，保證臨床用藥的安全性提供了參考。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀(Waters e2695，PDA檢測器)。色譜柱：Agilent Eclipse Plus C8(5μm，4.6mm×250mm)。布魯克Impact II飛行時間質譜儀，電噴霧電離源(ESI)。AX205分析天平(瑞士萬通)。

1.2 試藥

乙腈為色譜純，水為超純水，醋酸鈉和冰醋酸等其他試劑為分析純。注射用頭孢呋辛鈉A廠家(批號：17011614)和B廠家(批號：20170701)均為0.75g，原研品“西力欣”(注射用頭孢呋辛鈉，0.75g規(guī)格，批號：J853，葛蘭素制藥公司生產)。雜質對照品A(批號：17-04-1901，純度95.3%)、E(批號：17-05-2005，純度95.9%)、H(批號：17-04-2003，純度98.7%)由Sinco pharmachem公司提供，B(批號：3-NAV-50-1，純度97.0%)、C(批號：7-FLI-89-1，純度96.0%)、D(批號：17-04-2002，純度95.5%)、F(批號：21-MAY-17-12，純度97.2%)、G(批號：2464-065A10，純度96.8%)、I(批號：2-MSW-107-1，純度97.0%)雜質對照品由LGC公司提供，頭孢呋辛對照品(批號：130493-201105，含量92.1%)由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

照《中國藥典》2015年版二部“注射用頭孢呋辛鈉”項下的有關物質檢查方法進行測定。

2.2 有關物質方法學驗證

2.2.1 專屬性

分別稱取頭孢呋辛及各雜質對照品適量，分別配制成濃度約為0.1mg/mL的儲備液，再稀釋為0.025mg/mL的溶液，進樣，進行各組分的定位。同時配制各組分的混合溶液，記錄色譜圖，結果顯示各相鄰峰的分離度均大于1.5，說明本方法的專屬性良好。

圖中已積分的各峰依次分別為雜質I和A、頭孢呋辛、雜質F、E、C、B、H、G及雜質D(圖1)。

2.2.2 強制降解試驗

取供試品適量在水解(60℃, 30min)、堿降解(1mol/L的氫氧化鈉溶液)、酸降解(1mol/L的鹽酸溶液)、氧化降解(1%的H2O2溶液)、高溫(105℃, 16h)、光照[(4500±500)Lx, 4d]條件下破壞后進行測定，結果顯示各破壞條件下主峰與雜質能有效分離。各破壞條件下本品的降解雜質產生情況見表1。

2.2.3 定量限和檢測限

取頭孢呋辛和各雜質對照品的儲備液，采用逐級稀釋法制備稀釋溶液，進樣20μL，取相當于基線噪聲10倍時溶液濃度做為最低定量限，取相當于基線噪聲3倍時溶液濃度做為最低檢測限，記錄色譜圖。經計算，雜質I的最低定量限約為主成分的0.007%，最低檢測限約為主成分的0.002%；雜質A的最低定量限約為主成分的0.04%，最低檢測限約為主成分的0.01%；其他組分的最低定量限約為主成分的0.07%，最低檢測限約為主成分的0.02%。

2.3.4 其他項目

圖1 雜質混合溶液色譜圖Fig. 1 The chromatogram of impurity mixed solution

系統(tǒng)適用性、線性與范圍、準確度、重復性、中間精密度等均滿足《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》的要求。

表1 頭孢呋辛各雜質降解途徑分析Tab. 1 The impurities degradation pathway of cefuroxime sodium

2.4 雜質測定結果

分別配制國內兩個廠家產品和原研品的供試品溶液，進樣進行有關物質測定，結果見表2。

由表2可知，同原研品相比，國內兩個廠家的雜質個數較原研品稍少，但是雜質的總量稍大。不同來源樣品中檢出的主要雜質(接近或超過0.1%)相同，分別為相對保留時間為0.86、1.68和1.84的雜質。

2.5 雜質定性研究

表2 頭孢呋辛鈉雜質譜比較Tab. 2 Comparison of the impurity profiles of cefuroxime sodium

為明確各樣品中檢出主要雜質的結構和來源，本研究改進了液相色譜條件(將有關物質方法中的流動相A改變?yōu)?mmol/L的乙酸銨溶液，用甲酸調節(jié)pH至3.4，以與質譜體系兼容，其他條件不變)，以使色譜流出物用于質譜分析。

質譜分析條件：離子化方式：ESI(+)；數據采集范圍m/z50～600；霧化氣壓力：0.4Bar，干燥氣溫度：180℃，干燥氣流速：4L/min，碰撞電壓：7eV；毛細管電壓：4kV，錐孔電壓：2kV。

3個廠家的產品中均出現了3個較大的雜質(相對于主峰的保留時間分別為0.86、1.68和1.84)，其中國內兩個廠家這3個雜質均超過了0.1%，分別與已知雜質A、E、H的相對保留時間基本一致，為進一步確認雜質的結構，本研究采用LC-MS對這3個雜質峰的截留物和已知雜質A、E、H進行了對比分析，相對保留時間為0.86雜質的分子離子峰[M+H]+的質量數質荷比為382.0666，與雜質A的質量數相符；相對保留時間為1.68雜質的分子離子峰[M+Na]+的質量數質荷比為447.0562，與雜質E的質量數相符；相對保留時間為1.84雜質的分子離子峰[M+H]+的質量數質荷比為364.0583，與雜質H的質量數相符；同時對各雜質進行了二級質譜分析，相對于主峰的保留時間分別為0.86、1.68和1.84的3個雜質的一級、二級碎片峰分別與已知雜質A、E、H質譜圖一致，可以推定為對應的已知雜質。各雜質的一級、二級質譜圖，以及相應的裂解途徑見圖2～4。

3 討論

不同來源產品中檢出的3個較大雜質分別為雜質A(去氨甲酰頭孢呋辛)，為頭孢呋辛鈉在酸性等條件下水解脫去甲酰胺基團而得；雜質E(頭孢呋辛反式異構體)為頭孢呋辛鈉原料藥合成過程中的工藝雜質，也可能由于頭孢呋辛鈉在存放過程中結構發(fā)生反轉而得到的反式異構體；雜質H(頭孢呋辛內酯)，為頭孢呋辛或去氨甲酰頭孢呋辛在存放過程中由于高溫或光照等的影響而發(fā)生分子內酯化反應而得的內酯物；上述3個雜質均可由頭孢呋辛鈉降解產生，需要有針對性地制定科學的限度，以更好控制產品質量。

目前中國藥典中有關物質方法對雜質的分離能力和檢出能力均較好，適用于本品的有關物質檢測，但是其控制單個雜質的限度為1.0，總雜質的限度為3.0%。尚不滿足目前藥品技術審評審批的技術要求，建議將雜質A、E、H作為已知雜質進行控制(本研究采用雜質對照品進行了校正因子測定，雜質A、E、H相對于主成分校正因子分別為0.91、1.09和1.00，可以采用不加校正因子的主成分自身對照法計算雜質含量)，限度訂為1.0%，同時增加對未知雜質的控制，限度參照EMA抗生素有關物質標準的指導原則[7]，訂為0.2%，總雜質的限度仍為3.0%。

圖2 雜質A的一級、二級質譜圖及可能的裂解途徑Fig. 2 MS and MS2 spectrum of impurity A and fragmentation pathway of impurity A

本文對中國藥典2015年版注射用頭孢呋辛鈉有關物質方法對雜質的分離和檢出能力進行了驗證，結果表明適用于注射用頭孢呋辛鈉的有關物質檢測；對比分析了兩個國內廠家產品和原研產品的雜質譜情況，結果顯示雜質個數和雜質含量沒有顯著性差別，并對樣品中檢出的較大雜質進行了定性分析；同時對《中國藥典》2015年版注射用頭孢呋辛鈉的有關物質限度控制給出了合理的建議，為更好地保證注射用頭孢呋辛鈉產品質量提供了參考。

圖3 雜質E的一級、二級質譜圖及可能的裂解途徑Fig. 3 MS and MS2 spectrum of impurity E and fragmentation pathway of impurity E

圖4 雜質H的一級、二級質譜圖及可能的裂解途徑Fig. 4 MS and MS2 spectrum of impurity H and fragmentation pathway of impurity H