王欣榮 張雪霞 褚以文 鄭智慧 茍小軍 路新華 王勇軍

（1 抗生素研究與再評(píng)價(jià)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 610052；2 華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，石家莊 050015)

菌渣是產(chǎn)生于微生物藥物提取過(guò)程中的工業(yè)廢棄物，主要含有已滅活的菌絲體、殘余培養(yǎng)基、微生物代謝產(chǎn)物、部分殘留效價(jià)，以及提取時(shí)加入的絮凝劑、助濾劑等成分。微生物素發(fā)酵產(chǎn)生的菌渣中抗菌素殘留較高，如頭孢菌素C在菌渣中的殘留約2～2.5mg/g，青霉素在菌渣中的殘留約1～2mg/g，紅霉素在菌渣中的殘留約0.2～0.9mg/g，環(huán)孢菌素在菌渣中的殘留約0.5～2mg/g，環(huán)孢菌素在菌渣中的殘留約0.1～0.4mg/g，這些殘留物最終都會(huì)進(jìn)入環(huán)境中，日積月累可能會(huì)導(dǎo)致微生物逐漸產(chǎn)生耐藥性和其它未知的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，2008年被列入《國(guó)家危險(xiǎn)廢物目錄》[1]。現(xiàn)有菌渣無(wú)害化減量化處置技術(shù)如焚燒、填理以及制造肥料和飼料等普遍存在成本高、二次污染、殘留藥物積累等負(fù)面效應(yīng)和隱患[2]。我國(guó)已經(jīng)成為全球最大的抗生素原料藥生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，原料藥產(chǎn)量已占全球總產(chǎn)量80%，其中出口占到全世界原料藥市場(chǎng)的70%以上。2012年全國(guó)抗生素產(chǎn)量約14萬(wàn)噸，相應(yīng)產(chǎn)生菌渣超過(guò)150萬(wàn)噸，因此探討菌渣無(wú)害化、減量化處理顯得尤為重要[3]。

本研究以環(huán)孢菌素菌渣作為處理對(duì)象，研究采用多種嗜熱微生物進(jìn)行無(wú)害化、減量化處理，實(shí)現(xiàn)環(huán)孢菌素生產(chǎn)過(guò)程中的菌渣減量排放和基本去除環(huán)孢菌素殘留。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

嗜熱微生物1#：厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)、嗜熱微生物2#：土芽孢桿菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)和極端嗜熱菌3#：Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c，本研究組保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB平板及斜面培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物8，氯化鈉8，瓊脂16，pH自然。

極端嗜熱菌YPG改性平板及斜面培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，磷酸氫二鉀2，自來(lái)水配制，pH7.2～7.4。

LB種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，自來(lái)水配制，pH6.8～7.0。

極端嗜熱菌種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，磷酸氫二鉀2，自來(lái)水配制，pH6.8～7.0。

LB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，自來(lái)水配制，pH6.8～7.0。

極端嗜熱菌發(fā)酵培養(yǎng)(g/L)：葡萄糖8，蛋白胨10，酵母膏12，氯化鈉8，磷酸氫二鉀2，自來(lái)水配制，pH6.8～7.0。

1.1.3 試劑與儀器

試劑：試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，環(huán)孢菌素對(duì)照品購(gòu)自美國(guó)藥典委員會(huì)。

儀器：立式蒸氣壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Agilent technologies1200高效液相色譜儀；搖床(美國(guó)NBS)；發(fā)酵槽，200L微生物發(fā)酵罐系統(tǒng)(華北制藥工程裝備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)方法

培養(yǎng)溫度：厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus mongoliensisSIIA-1501a)，培養(yǎng)溫度55℃，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B；嗜熱土芽孢桿菌(Geobacillussp. SIIA-1501g)，培養(yǎng)溫度65～70℃，培養(yǎng)基為L(zhǎng)B；極端嗜熱菌(Calditerricola yamamuraeSIIA-1501c)，培養(yǎng)溫度75℃。

斜面及平板培養(yǎng)方法：無(wú)菌環(huán)取菌種涂布于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3～5d。

搖瓶種子培養(yǎng)：分別從各菌株斜面上刮菌苔接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1～2d，搖床轉(zhuǎn)速220r/min。待各菌液A600＞1.5，并瓶。并瓶后的種子液接種于發(fā)酵罐。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：200L發(fā)酵罐內(nèi)裝150L發(fā)酵培養(yǎng)基,接種量0.1%～0.5%(V/V)，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速100～200r/min，通氣量1:0.1～0.3，A600＞1.5終止培養(yǎng)。菌劑成品發(fā)酵液直接分裝10kg/桶。

1.2.2 菌渣的堆肥處理

試驗(yàn)組：取環(huán)孢菌素菌渣，加自來(lái)水調(diào)成含水量50%～65%，加入0.1%菌劑(W/W)，用鏟車(chē)翻拌均勻，通氣量：0.1vvm。每隔3h測(cè)量1次堆心溫度，溫度超過(guò)對(duì)應(yīng)嗜熱菌的上限翻拋一次物料。當(dāng)一個(gè)處理階段后期溫度不再升高后，加入下一種菌劑(先加厭氧芽孢桿菌：菌劑A，然后是嗜熱地芽孢桿菌：菌劑B，最后加入極端嗜熱菌：菌劑C)。其中厭氧芽孢桿菌處理時(shí)溫度不能超過(guò)65℃，嗜熱地芽孢桿菌不超過(guò)80℃，而極端嗜熱菌不超過(guò)105℃。

空白對(duì)照組：取環(huán)孢菌素菌渣，加自來(lái)水調(diào)成含水量50%～65%，用鏟車(chē)翻拌均勻，通氣量：0.1vvm。每隔3h測(cè)量1次堆心溫度。

1.2.3 環(huán)孢菌素效價(jià)分析方法[4]

高效液相色譜系統(tǒng)為Agilent1200，色譜柱為C18反相柱(250mm×4.6mm, 5μm)；流動(dòng)相為乙腈:水=80:20；柱溫70℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；流速1.5mL/min；進(jìn)樣量20μL。

1.2.4 碳氮磷鉀分析[5]

按照有機(jī)肥料標(biāo)準(zhǔn)NY525-2012測(cè)定全碳、全磷、全鉀和全氮的含量。

2 結(jié)果

2.1 堆肥處理過(guò)程中的各項(xiàng)指標(biāo)變化情況

堆肥過(guò)程中的溫度變化是堆體內(nèi)微生物活性變化的重要反應(yīng)。堆體中的水分不僅可以作為微生物代謝和生理活動(dòng)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的載體，還可以蒸發(fā)帶走熱量，調(diào)節(jié)堆體溫度。微生物在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中分解和利用殘存蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、無(wú)機(jī)鹽和其它有機(jī)物時(shí)放出熱量使堆體溫度升高含水量減少，堆體重量減少，環(huán)孢菌素殘留減少?？瞻讓?duì)照組具體指標(biāo)見(jiàn)表1，試驗(yàn)組見(jiàn)表2。

從表1可知，處理過(guò)程中，由于只有環(huán)境微生物作用，生產(chǎn)過(guò)程漫長(zhǎng)，堆心最高溫度為62.6℃。菌渣經(jīng)過(guò)45d自然堆肥，環(huán)孢菌素菌渣減量40%以上，廢渣中環(huán)孢菌素殘留為300mg/L以上。

從表2可知，環(huán)孢菌素菌渣經(jīng)過(guò)厭氧芽孢桿菌堆肥處理，第2天溫度達(dá)到接近50℃，第7天溫度開(kāi)始降低，說(shuō)明該菌生長(zhǎng)代謝開(kāi)始減速。第8天接種嗜熱地芽孢桿菌，堆體迅速升溫，到第13天生長(zhǎng)代謝開(kāi)始減速。第14天接種極端嗜熱菌，堆心溫度最高到達(dá)105.6℃。在整個(gè)過(guò)程中，從第2天起，菌渣中的主要菌群已變?yōu)榻臃N菌株，優(yōu)勢(shì)菌群依次為：1#、 2#和3#，表明菌渣的減量變化因這3種菌的活動(dòng)引起的。

表1 試驗(yàn)組堆肥過(guò)程各指標(biāo)變化情況Tab. 1 The course of batch culture (n=5)

表2 試驗(yàn)組堆肥過(guò)程各指標(biāo)變化情況Tab. 2 The course of batch culture (n=5)

經(jīng)過(guò)3周的新工藝處理，環(huán)孢菌素菌渣減量80%以上，廢渣中環(huán)孢菌素殘留去除率近99%。經(jīng)過(guò)處理的菌渣，環(huán)孢菌素A的殘留低于10mg/L，進(jìn)入環(huán)境后，環(huán)孢菌素A的殘留遠(yuǎn)低于其作用微生物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)(256～512mg/L)[8]，已較難以引起耐藥性的產(chǎn)生，且環(huán)孢菌素A通常情況不作為抗生素使用，因而已不具有環(huán)境危害性。

2.2 總氮、總磷和總鉀的變化

堆肥產(chǎn)熱本質(zhì)上是微生物新陳代謝的過(guò)程，有機(jī)物在此過(guò)程中被不斷分解，并以NH3、H2O、CO2等形式揮發(fā)損失，造成氮元素和碳元素絕對(duì)量及總干物質(zhì)質(zhì)量逐漸減少，并且碳的消耗速率快于氮源的消耗，堆肥結(jié)束時(shí)，物料中的磷鉀等養(yǎng)分相對(duì)含量高于原始物料，含水率逐步下降[6]。在本試驗(yàn)中引入了超高溫菌，大部分氮源也被水解以NH3的形式揮發(fā)，因此在整個(gè)處理過(guò)程中，物料的C/N呈現(xiàn)一個(gè)先下降后回升的過(guò)程，見(jiàn)圖1。這是因?yàn)橹袦鼐挠袡C(jī)物，使碳源消耗以二氧化碳的形式釋放，物料的C/N下降；后期菌渣在超高溫菌的作用下，菌渣溫度進(jìn)一步升高，使得NH3揮發(fā)，物料的C/N下降。最后的剩余的物料絕大部分碳源和氮源被消耗，殘留物主要為磷鉀等成分。

3 結(jié)論

圖1 堆肥過(guò)程中C/N的變化Fig. 1 The change of C/N in the composting process

環(huán)孢菌素菌渣依次經(jīng)過(guò)厭氧芽孢桿菌堆肥處理5～8d，嗜熱地芽孢桿菌堆肥處理4～7d和極端嗜熱菌堆肥處理4～6d，環(huán)孢菌素菌渣減量80%以上，廢渣中環(huán)孢菌素殘留去除率近99%。常用的堆肥處理菌渣方式是多菌混合處理，弊端在于每種菌體需要的生長(zhǎng)溫度不一樣，而且存在相互抑制的現(xiàn)象，并且周期達(dá)到40d，藥物殘留高。本工藝分階段補(bǔ)入不同細(xì)菌，生長(zhǎng)溫度逐步提高，每種菌都能夠最大限度發(fā)揮其生理功能，前一步菌體死亡后又成為下一步菌的營(yíng)養(yǎng)。最后加入超高溫嗜熱菌(Calditerricola yamamurae)使得堆肥溫度達(dá)到100℃以上，消耗有機(jī)質(zhì)的同時(shí)又使絕大部分NH3得以釋放。由于雷帕霉素、他克莫司、霉酚酸和咪唑立賓等菌渣性質(zhì)與環(huán)孢菌素A菌渣類(lèi)似，可以研究將本工藝用于這些菌渣的無(wú)害化和減量化處理。

在早期，抗生素菌渣一直被作為工業(yè)廢棄物而丟棄。為了有效利用抗生素菌渣，從20世紀(jì)50年代以來(lái)，抗生素菌渣被廣泛用作動(dòng)物蛋白飼料和飼料藥用添加劑。但是其中殘留的抗生素會(huì)在動(dòng)物體內(nèi)富集，并通過(guò)泌乳、產(chǎn)蛋而進(jìn)入奶、蛋中，進(jìn)而對(duì)人類(lèi)產(chǎn)生毒、副作用，使人體內(nèi)的致病菌產(chǎn)生抗藥性。2002年2月，農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布176號(hào)公告，禁止抗生素菌渣在飼料和動(dòng)物飲用水中使用[7]，大部分抗生素生產(chǎn)廠無(wú)力處理生產(chǎn)過(guò)程產(chǎn)生的大量菌渣，以每噸數(shù)千元的代價(jià)交由第三方處理。采用三聯(lián)菌處理環(huán)孢菌素菌渣，實(shí)現(xiàn)了無(wú)害化和減量化，廢渣中環(huán)孢菌素殘留基本去除，經(jīng)處理后的殘?jiān)胸S富的磷鉀等成分，且沒(méi)有其它危險(xiǎn)廢物特性，可進(jìn)一步探討用于生產(chǎn)有機(jī)肥，具備較好的環(huán)境效益和社會(huì)效益。