張敏娜，鐘 鳴，王光輝，吳景龍

隨著我國(guó)老齡化社會(huì)現(xiàn)狀的加劇，老年人的生活質(zhì)量也日益成為醫(yī)學(xué)關(guān)注和研究的問題，隨著年齡的增加老年人往往出現(xiàn)為學(xué)習(xí)能力和記憶能力的下降，重者表現(xiàn)為阿爾茨海默病等疾病，嚴(yán)重影響老年人的生活質(zhì)量。

大腦海馬區(qū)作為學(xué)習(xí)和記憶的中樞負(fù)責(zé)處理感外界感覺和知覺刺激信號(hào)，并且通過(guò)整合形成記憶和學(xué)習(xí)能力。隨著年齡增長(zhǎng)，老年人出現(xiàn)的記憶力減退、認(rèn)知能力受損、對(duì)外界刺激反應(yīng)遲鈍等表現(xiàn)與海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡及功能減退有關(guān)[1,2]。相關(guān)研究顯示老齡誘發(fā)免疫系統(tǒng)紊亂和中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥損傷是神經(jīng)元死亡的重要原因[3，4]。知母皂苷B-Ⅱ(TB-Ⅱ)是自百合科中藥植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge)的主要活性成分[5]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)TB-Ⅱ?qū)夏臧V呆癥、腦血管疾病等導(dǎo)致的認(rèn)知功能障礙和學(xué)習(xí)記憶障礙有改善作用[6]，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

本研究初步探討TB-II對(duì)老齡大鼠學(xué)習(xí)和記憶行為的影響以及對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)元的作用，旨在探索一條改善老齡大腦的學(xué)習(xí)和記憶功能、延緩腦衰老的新途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SD大鼠體重260～280 g，雌雄不限，SPF級(jí)。濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁育和養(yǎng)殖。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)相關(guān)倫理學(xué)法規(guī)盡量減少其痛苦和死亡。22月齡SD大鼠60只，雌雄不限，隨機(jī)分為老齡大鼠對(duì)照組(15只)、根據(jù)TB-Ⅱ藥物動(dòng)力學(xué)特征設(shè)置TB-Ⅱ 1 mg/kg組(15只)、TB-Ⅱ 2 mg/kg組(15只)和TB-Ⅱ 1 mg/kg組(15只)。2月齡大鼠設(shè)立為青年對(duì)照組 (15只)。大鼠稱重記錄，連續(xù)5 d，生理鹽水溶解TB-Ⅱ制成溶液，每24 h經(jīng)鼠尾靜脈給藥相應(yīng)劑量，對(duì)照組根據(jù)體重注射生理鹽水。

1.2 主要試劑與儀器、藥品和主要儀器 藥品知母皂苷BⅡ購(gòu)買自成都德斯特生物科技有限公司，ELISA試劑盒由美國(guó)R&D Systems公司提供，水迷宮視頻分析系統(tǒng)設(shè)備購(gòu)自海欣軟信息科技有限公司。TUNEL試劑盒來(lái)自碧云天生物技術(shù)有限公司。Agilent 1260 Infinity II Prime液相色譜儀和臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)買自美國(guó)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 水迷宮定位航行試驗(yàn)(Hidden Platform Test) 測(cè)試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)空間位置覺和空間定位學(xué)習(xí)記憶能力。定位航行試驗(yàn)歷時(shí)5 d,每天同一時(shí)間和地點(diǎn)將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中各一次,記錄其入水到站立于水面下隱藏平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期(escape latency)。開啟視頻分析系統(tǒng)以s為單位每24 h記錄一次，連續(xù)進(jìn)行5次。

1.3.2 ELISA 法測(cè)腦脊液IL-6和TNF-α 濃度 大鼠麻醉固定，剝離頸部靠近顱底肌肉,用微量進(jìn)樣器刺入枕骨大孔約2 mm，采集100 μl腦脊液。CSF標(biāo)本加入后與酶標(biāo)板上抗體結(jié)合，沖洗，加辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記親合素，親合素復(fù)合酶與夾心免疫復(fù)合物進(jìn)行連接，洗滌其他游離成分。加入顯色劑經(jīng)酶催化呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液變黃色，讀取450 nm處酶標(biāo)儀顯示OD值，計(jì)算IL-6、TNF-α濃度。

1.3.3 海馬區(qū)細(xì)胞凋亡檢測(cè) 麻醉處死大鼠取腦，精心剝離大腦海馬做成組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、抗原修復(fù)破膜、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、DAB顯色、復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、中性樹膠封片后顯微鏡下照相，圖像處理軟件分析細(xì)胞。光鏡下凋亡細(xì)胞呈棕黃色,于高倍鏡視野下隨機(jī)觀察來(lái)自不同切片20個(gè)視野,計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞所占比值。

1.3.4 HPLC法測(cè)DA、NE和5-HT濃度 動(dòng)物處死后剝離海馬，比例控制為海馬組織重量：PBS 達(dá)到1∶20，平均分為3份，分別加乙腈、三氯乙酸和高氯酸沉淀蛋白勻漿冰浴條件混勻。4 ℃ 12000 rpm離心20 min，取上清液400 μml加入氫氧化鈉溶液(8 mol/L)調(diào)整pH值至中性，經(jīng)濾膜過(guò)濾后測(cè)定DA、NE和5-HT濃度。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀測(cè) 老齡大鼠逃避潛伏期較青年對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。在連續(xù)5次的實(shí)驗(yàn)中，與老齡對(duì)照組相比給藥組第一個(gè)24 h逃避潛伏期差異不明顯；第48小時(shí)和第72小時(shí)逃避潛伏期縮短 (P<0.05)；第96小時(shí)和第120小時(shí)逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各組逃避潛伏期(見表1)。

表1 大鼠逃避潛伏期比較

與老年對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01

2.2 腦脊液IL-6和TNF-α濃度 老齡對(duì)照組與青年對(duì)照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)， 給藥組隨著劑量增加，與老年對(duì)照組相比IL-6和TNF-α濃度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) (見圖1)。

與老齡對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01圖1 大鼠CSF IL-6和TNF-α濃度

2.3 海馬組織神經(jīng)元凋亡檢測(cè) 老齡對(duì)照組較青年對(duì)照組凋亡神經(jīng)細(xì)胞明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；給藥后與老年對(duì)照組相比神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)(見圖2、表2)。

A.青年對(duì)照組;B.老齡對(duì)照組;C.TB-Ⅱ 4 mg/kg給藥組圖2 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡情況(×400)

組別細(xì)胞凋亡率青年對(duì)照組老齡對(duì)照組TB-Ⅱ 1 mg/kgTB-Ⅱ 2 mg/kgTB-Ⅱ 4 mg/kg6.25±4.82??18.46±8.3514.90±5.82?12.85±6.56?10.13±6.83??

與老齡對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01

2.4 大鼠海馬組織主要神經(jīng)遞質(zhì)含量 老齡大鼠海馬組織DA、NE、5-HT與青年組大鼠相比含量明顯降低，較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，P<0.01)；給藥后DA、NE、5-HT與老年對(duì)照組比含量均明顯上升，呈劑量依賴性，較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，P<0.01)，3種神經(jīng)遞質(zhì)含量測(cè)定比較(見表3)。

表3 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)含量比較

與老年對(duì)照組比較*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

神經(jīng)生物學(xué)研究結(jié)果表明大腦衰老與神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎癥互為因果，老年性慢性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元所處微環(huán)境穩(wěn)態(tài)被打破，炎癥細(xì)胞因子和相關(guān)抑制因子平衡失調(diào)，引發(fā)神經(jīng)元變性、壞死和凋亡[7]。TNF-α既是應(yīng)激損傷反應(yīng)的核心炎性因子，又是引發(fā)多種神經(jīng)退行性疾病的主要炎性因子。

TNF-α對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制包括收縮血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞、增加內(nèi)皮細(xì)胞間隙、腦部毛細(xì)血管通透性增加、引發(fā)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和腦組織水腫，繼而誘導(dǎo)IL-1β表達(dá)增加，IL-1β誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生合成分泌NO，NO作為凋亡信號(hào)啟動(dòng)分子進(jìn)一步誘發(fā)細(xì)胞凋亡發(fā)生。另一方面TNF-α通過(guò)IL-1受體和L-型鈣通道增加鈣調(diào)磷酸神經(jīng)酶活性，引發(fā)N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[8]。低濃度IL-6在腦損傷中有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用,但是病理情況下高濃度IL-6則表現(xiàn)為神經(jīng)毒性作用，誘發(fā)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞變性和死亡。隨著TNF-α、IL-6等炎性因子持續(xù)損傷作用加劇，最終導(dǎo)致老年人記憶能力減退、認(rèn)知功能下降等臨床癥狀[9～11]。

前期研究發(fā)現(xiàn)知母皂苷能明顯對(duì)抗脂多糖LPS導(dǎo)致的IL-1β 和iNOS表達(dá)水平增加，減輕海馬區(qū)炎癥，明顯改善大鼠學(xué)習(xí)記和記憶行為[12]。另?yè)?jù)Patterson等[13～15]研究發(fā)現(xiàn)知母皂苷BⅡ提高IL-10和抗炎因子的表達(dá)，從而起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用。在以上研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)選取22月齡老齡大鼠為研究對(duì)象，與2月齡青年大鼠相比各項(xiàng)指標(biāo)符合自然衰老大鼠的生物學(xué)屬性，符合探索老齡大鼠學(xué)習(xí)和記憶功能的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示知母皂苷BⅡ可顯著降低老齡大鼠腦脊液中TNF-α和IL-6水平，并與給藥劑量成正相關(guān)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明知母皂苷BⅡ抑制老年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)知母皂苷BⅡ給藥后的老齡組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯減少，海馬區(qū)DA、NE及5-HT神經(jīng)遞質(zhì)明顯增加，動(dòng)物行為學(xué)表現(xiàn)為從入水游泳到找到并且站立于水面下隱藏平臺(tái)的時(shí)間明顯縮短，即感知空間位置覺的能力和空間定位學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。

綜上所述，知母皂苷BⅡ可改善自然衰老大鼠學(xué)習(xí)和記憶行為，其作用機(jī)制與抑制神經(jīng)損傷性炎性因子TNF-α和IL-6的表達(dá)、抑制大腦海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、改善神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境、存活神經(jīng)元數(shù)量增加、神經(jīng)元合成DA、NE及5-HT等神經(jīng)遞質(zhì)增加有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中可能涉及到較為復(fù)雜信號(hào)通路如抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路和相關(guān)基因表達(dá)等，為下一步深入研究知母皂苷BⅡ分子藥理學(xué)機(jī)制指明了方向。