曹香玲，吳新貴，張俊川，周麗芳，劉建偉

缺血性卒中不僅造成大腦神經功能缺損，還能造成其他系統(tǒng)嚴重的并發(fā)癥。研究表明，缺血性卒中常會繼發(fā)心臟、腎臟等臟器損害[1,2]，引起心肌組織出血、缺血、腎臟組織腫脹變性及低灌注性損傷[3,4]。在腦梗死臨床治療中，更多的集中在減輕腦損傷及神經功能缺損康復方面，而針對其它腦梗死并發(fā)癥特別是腎損傷的重視程度、治療和研究較少，因此在促進腦梗死患者神經功能恢復的同時，針對其并發(fā)癥的治療也十分重要，這直接影響到患者受損神經功能的近期及遠期恢復。本實驗通過觀察急性腦梗死大鼠不同時間點腎臟形態(tài)和功能結構的改變，了解急性腦梗死對腎臟的影響，為卒中后繼發(fā)腎損傷的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 挑選SPF級健康雄性SD大鼠48只，平均體重(270±50)g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK桂2014-0002。實驗動物使用許可證號：SYXK(桂)2014-0003。實驗前12 h禁食不禁水。采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術組、模型組，每組再隨機分為1 d、3 d、7 d、14 d 4個亞組，每個亞組6只。

1.2 方 法

1.2.1 建立腦梗死模型 模型組采用改良Longa線栓法[5]，制備右側大腦中動脈梗死(MCAO)大鼠模型。以10%腹腔注射(35 mg/kg劑量)麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定，頸部消毒后正中切開，鈍性分離暴露右側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ICA)、頸內動脈(ECA)，在血管下方分別放置絲線并用止血鉗固定，以懸掛絲線的方式三方反向牽引，暫時阻斷CCA、ICA、ECA血流，在距ICA分叉5 mm處，用微型眼科剪剪開CCA上1/3動脈壁，插入線栓，沿ICA向上平行推進(19±0.5)mm，結扎ICA，并于血管剪開口處前后結扎CCA以固定線栓、止血，消毒后逐層縫合切口。假手術組大鼠只分離右側CCA、ICA、ECA，不插線栓不結扎，消毒后縫合切口。術中及術后注意大鼠保溫。

1.2.2 模型納入標準 急性MCAO大鼠模型制備參考Bederson 4分5級法[6]在大鼠手術蘇醒后24 h內，出現(xiàn)以下任意兩項即為造模成功：(1)左側肢體疼痛刺激后收縮現(xiàn)象消失；(2)向左傾倒或轉圈；(3)提尾時左上肢屈曲抱胸，不能向前伸直。

1.2.3 標本采集 兩組大鼠分別在1 d、3 d、7 d、14 d 4個時間點隨機選取6只，麻醉成功后仰臥固定，將大鼠沿腹部正中線由會陰上方至膈肌剪開，完全暴露腹部臟器，快速找到腹主動脈，采集腹主動脈血4 ml，室溫下靜置2 h后，4 ℃ 3000/min離心10 min取上清液，全自動生化分析儀常規(guī)測定Cr、BUN、Cys C含量；放血處死大鼠后，剪去左腎組織，生理鹽水清洗血漬，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE、Masson染色，光學顯微鏡下觀察腎臟結構形態(tài)的改變。

2 結 果

2.1 大鼠急性腦梗死模型評價 模型組大鼠術后第一天精神煩躁，原地追尾轉圈，隨著時間延長，大鼠右側瞳孔縮小、眼瞼下垂、眼球內陷，甚至少量血漬，出現(xiàn)Honer癥；精神逐漸變差，萎靡，倦怠，活動減少，行動遲緩，弓背滯伏，進食、進水、排尿減少，大便質硬干結，量少；皮毛色澤晦暗、易掉毛，體型逐漸消瘦，術后6 d～7 d時，大鼠體重不再下降，精神較前稍好轉，少量進食，但仍活動較少，身體易左側傾倒。假手術組大鼠未出現(xiàn)上述神經缺損癥狀，攝水飲食正常，可排除腦梗死。

2.2 大鼠腎組織病理學改變 肉眼觀察，假手術組大鼠的腎臟形態(tài)及大小正常，顏色潤澤；模型組大鼠，1 d、3 d時腎臟腫脹，色澤暗紅，7 d及14 d時部分大鼠腎臟組織體積縮小，顏色暗紅，腎臟表面散在少量出血點。

2.2.1 HE染色 假手術組大鼠腎組織切片各時間段結構清晰，無細胞腫脹、充血，腎小管管腔完整，腎小球形態(tài)正常；模型組第一天、第3天腎組織的病理變化不明顯，偶見腎小管上皮細胞腫脹，腎小球未見明顯改變，第7天、第14天鏡下可見部分腎小管上皮細胞出現(xiàn)水腫、空泡化、刷狀緣消失，部分腎小球出現(xiàn)萎縮(見圖1)。

A：假手術組；B：模型組3 d；C：模型組7 d；D：模型組14 d圖1 各組大鼠術后1 d、3 d、7 d、14 d時腎組織HE染色(×200)

2.2.2 Masson染色 假手術組1 d、3 d、7 d、14 d各切片結構清晰，腎小管胞質、紅細胞呈暗紅色；模型組第一天、第3天腎組織未見明顯病理變化，第7天、14天鏡下可見部分腎小管上皮細胞附近出現(xiàn)綠色淡染，表明腎小管間質出現(xiàn)少量膠原纖維(見圖2)。

A：假手術組；B：模型組3 d；C：模型組7 d；D：模型組14 d圖2 各組大鼠術后1 d、3 d、7 d、14 d時腎組織Masson染色(×200)

2.3 大鼠血中Cr、BUN、Cys C濃度變化 大鼠腦梗死后1 d血清中Cr、BUN濃度有升高，但與假手術組(A組)比差異不顯著(P>0.05);而腦梗死后3 d、7 d、14 d時Cr、BUN濃度明顯升高,與假手術對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。模型組(B組)內Cr濃度術后14 d和1 d、3 d、7 d比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組內BUN濃度術后7 d和1 d、3 d、14 d比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；血清Cys C含量在腦梗死術后3 d明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);模型組內Cys C術后3 d和1 d、7 d、14 d比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示大鼠急性腦梗死后腎功能受損(見表1)。

表1 各時間點大鼠血清Cr、BUN、Cys C濃度變化

與假手術組相比*P>0.05；與假手術組相比#P<0.05

3 討 論

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)可誘發(fā)多系統(tǒng)并發(fā)癥，急性腎損傷是常見并發(fā)癥之一，腦梗死急性期伴發(fā)腎臟高灌注，損害腎小球基底膜，尿蛋白增多，隨著腎小球濾過率下降，腎功能指標血清UA、Cr、BUN、CysC水平升高[7～9]。腎損傷后導致的水鈉代謝紊亂、酸中毒及氮質代謝產物的積聚可導致患者神志淡漠或煩躁、抽搐、昏迷等神經系統(tǒng)癥狀的加重，甚至造成并發(fā)癥死亡。因此，卒中后評估并采取必要措施保護腎功能是降低急性卒中患者院內死亡風險的先決條件，這也直接影響到患者受損的神經功能的近期及遠期恢復。因此，在治療急性腦梗死神經功能缺損的同時，針對腎損傷的治療有其重要意義。

本實驗通過腎組織HE及Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)，ACI大鼠腎臟組織在第1天、第3天時可見少量腎小管上皮細胞腫脹；在第7天時出現(xiàn)腎小管上皮細胞水腫、壞死、刷狀緣消失；第14天時損傷持續(xù)加重，說明腦梗死大鼠腎組織存在實質性的損傷，這與前人觀察大鼠腦梗死會引起腎組織損傷結果相一致。張新江等[10]發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注6 h時大鼠腎小管上皮細胞出現(xiàn)渾濁腫脹；24 h后觀察到腎小球毛細血管腔閉鎖，體積縮小，遠曲小管和集合管上皮細胞廣泛壞死[11]。伍麗娜等[12]在大鼠腦缺血再灌注后2 h、24 h、48 h時觀察發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞水腫，并有核固縮的表現(xiàn)，伴炎性細胞浸潤,其他研究同樣發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后大鼠腎小管上皮細胞變性，有蛋白管型[13]。以上實驗觀察時間多在72 h內，而隨著腦梗死時間的延長，腎組織形態(tài)及功能改變未做持續(xù)研究。本實驗與以往研究相比，持續(xù)動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)后期腎組織表面有散在出血點，腎組織出現(xiàn)纖維化，腎功能生化指標持續(xù)升高，表明腎組織存在損傷，且隨時間的延長，損傷逐漸加重。

腎小球濾過、重吸收功能下降，會引起Cr、BUN濃度升高，而CysC血清濃度與腎功能損害程度高度相關。本研究中發(fā)現(xiàn)與假手術組相比，模型組Cr濃度第1天、第3天差異不顯著；至第7天、第14天出現(xiàn)明顯上升，術后模型組大鼠CysC、BUN濃度持續(xù)升高并分別在術后第3天、第7天達到峰值，而由此我們推測腦梗死急性期身體處于“應激”狀態(tài)，會引起腎素-血管緊張素等過度分泌，導致腎臟血管劇烈收縮，血管痙攣供血不足而缺氧，當血管重新開放又引起腎缺血再灌注損傷，腎血漿流量及腎排泄濾過能力下降，Cr、BUN不能順利隨尿排出[14],從而出現(xiàn)血內肌酐、尿素氮、胱抑素C的持續(xù)升高[15,16]，同時也表明卒中后引起腎組織的持續(xù)性損傷。隨后CysC濃度逐漸降低，可能是因為CysC作用于半胱氨酸的巰基，對半胱氨酸酶的活性進行調節(jié)，對缺血性腦卒中起腦保護作用，與趙德強等[17]觀察缺血性腦卒中患者血清CysC變化的結果相一致。本研究病理結果顯示腦梗死術后1 d、3 d時腎組織損傷不明顯,而損傷初期尿素氮顯著升高，不排除腦梗死初期尿素氮濃度與外源性(蛋白質攝入量)、內源性(感染、腎上腺皮質激素的應用、胃腸出血等)尿素負荷的大小有關[18]。這些不確定因素都會導致尿素氮的水平不穩(wěn)定，故我們推測本實驗中BUN濃度在初期升高可能和應激反應、炎癥等內源性反應有關，導致腎功能上的損傷；在第14天降低可能與大鼠后期飲食、飲水量的改變等外源性因素有關。

急性腦梗死后根據(jù)腎損傷的發(fā)病原因，臨床上將其分為內源致病因素和外源致病因素，外源致病因素主要是對比劑、甘露醇及溶栓治療等引起的腎損傷；內源致病因素導致的腎損傷為腦部病變直接引起的急性腎損傷[19]，可能因缺血后腦缺血和水腫引起神經內分泌功能紊亂、交感神經興奮、腎素-血管緊張素分泌增加、腎血管舒張功能障礙，從而造成腎小管缺血性壞死[20]。同時，腦損傷導致機體應激和炎癥反應[21]，引起有害物質代謝能力下降，而炎癥因子激活免疫細胞和產生活性氧，可直接引起腎組織細胞損傷和腎血管痙攣，進一步加重腎損傷，導致神經源性腎功能障礙或急性腎衰竭[22,23]。此外，卒中可導致機體血容量下降，腎血管灌流不足，腎小球濾過率下降，引起腎前性AKI[24]。本研究中模型組Cr、BUN、CysC維持較長時間的高數(shù)值，提示腦梗死對腎功能的損傷是持續(xù)的，臨床中對腦梗死的治療應在卒中早期注意保護腎功能，避免腎性缺血，同時持續(xù)改善腦缺血，減輕神經內分泌功能紊亂，減輕內源性腎功能損害。本實驗中不足之處未記實驗大鼠尿量及測定24 h尿蛋白，不能精確測定大鼠尿量改變；同時未設置治療組，未進行卒中后腎功能損傷的針對性治療，后續(xù)的實驗我們將會進一步設置治療組，探索有效的治療方法，為臨床急性腦梗死后腎功能的改善提供治療依據(jù)。