王麗琨，周 鑫，伍國鋒，洪 震

癲癇是多種原因?qū)е碌穆阅X部疾病，全球約有5000萬癲癇患者[1]，美國約有300萬[2]，我國約有900～1000萬[3]，且每年以新增45萬的速度遞增[4]。約有30%的癲癇患者經(jīng)過系統(tǒng)正規(guī)的藥物治療，仍不能得到有效的控制，成為耐藥性癲癇。耐藥性癲癇模型則是研究耐藥機(jī)制及發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)的重要工具。杏仁核電刺激慢點(diǎn)燃癲癇模型是公認(rèn)的顳葉癲癇的模型。但制作耗時(shí)耗力，難以點(diǎn)燃，植入的電極頭容易脫落和感染。而匹羅卡品癲癇模型也是理想的顳葉癲癇模型，急性期表現(xiàn)為癲癇持續(xù)狀態(tài)，隨后有大約2 w的潛伏期是異常興奮性環(huán)路形成的關(guān)鍵時(shí)期，慢性期主要表現(xiàn)為自發(fā)性反復(fù)發(fā)作，但死亡率較高[5]，且對(duì)大鼠的腦組織損傷較重。本實(shí)驗(yàn)主要是對(duì)比兩種模型之間癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間、發(fā)作頻率、發(fā)作級(jí)別、腦電圖和超微結(jié)構(gòu)的差異，評(píng)估是否可用匹羅卡品模型來取代杏仁核電刺激慢點(diǎn)燃模型，以期能夠選擇出更適合研究耐藥機(jī)制的癲癇模型。

1 材料及方法

1.1 器材及試劑 DW-2000腦立體定向儀，BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),BL-420F刺激器，HF30型可拆式屏蔽室(成都泰盟科技有限公司制造)，鎳鉻漆包線(重慶儀表廠)，自制連接器，自制牙科鉆，自制深部電極，直徑0.1 mm，刺激電極。苯巴比妥注射液(上海新亞藥業(yè)有限公司)，卡馬西平(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院)匹羅卡品、阿托品(美國Sigma公司)，苯妥英鈉純品(武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 健康成年雄性SPF級(jí)SD大鼠130只，體重180～220 g，平均(200.5±4.3)g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)選擇10只作為正常組，余下120只分別進(jìn)行兩種模型制作。模型制作成功后分別選擇杏仁核模型和匹羅卡品模型，每組共10只進(jìn)行對(duì)比癲癇發(fā)作的級(jí)別、頻率和發(fā)作的時(shí)間。

1.3 杏仁核耐藥顳葉癲癇模型的制作 實(shí)驗(yàn)方法同本課題組先前發(fā)表的文章[6,7]雄性SD大鼠60只，模型制作成功后以苯妥英鈉(Phentoin，PHT)及苯巴比妥(Pentobarbital，PB)篩選耐藥模型，依據(jù)杏仁核后放電閾值(after discharges threshold,ADT)變化，應(yīng)用抗癲癇藥物后與對(duì)照ADT比較，給藥后ADT不增加或增加小于20%為耐藥模型；ADT增高20%以上納入藥物敏感；ADT值變化不定不納入實(shí)驗(yàn)分組。

1.4 匹羅卡品耐藥性顳葉癲癇模型的制作 選取雄性SD大鼠60只腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg[8～10]，直至出現(xiàn)4級(jí)及以上持續(xù)發(fā)作；癲癇持續(xù)狀態(tài) (status epilepticus，SE)出現(xiàn)持續(xù)90 min后，用地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。發(fā)生SE的大鼠約經(jīng)過10 d～14 d潛伏期，即進(jìn)入自發(fā)性發(fā)作階段。將14 d后有自發(fā)性發(fā)作的大鼠即為造模成功。在其右側(cè)杏仁核植入電極監(jiān)測(cè)腦電圖，植入方法同前[6,7],使用24 h視頻腦電監(jiān)護(hù)系統(tǒng)記錄大鼠發(fā)作頻率，持續(xù)時(shí)間及發(fā)作級(jí)別。用腦電圖監(jiān)測(cè)杏仁核放電的情況，記錄腦電圖的頻率、波幅、發(fā)作持續(xù)時(shí)間，共記錄2 w。2 w后開始篩選耐藥模型，腹腔注射PB[11]，總量30 mg/kg，每天兩次，給藥過程共持續(xù)2 w，記錄發(fā)作次數(shù)和腦電圖變化；用PB后癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā)作頻率減少大于50%的為藥物敏感的大鼠；用PB后癲癇發(fā)作持續(xù)的時(shí)間和發(fā)作的頻率減少小于50%的為耐PB的癲癇大鼠[8,12]。對(duì)耐PB的癲癇大鼠，繼續(xù)選用卡馬西平(Carbamazepine，CBZ)進(jìn)行耐藥性篩選，CBZ灌胃，40 mg/kg/次，1 d 3次，連續(xù)給藥14 d。判斷方法如前。

1.5 電鏡標(biāo)本制備及觀察判定 將動(dòng)物麻醉后固定，開胸暴露心臟后以4%多聚甲醛灌注，灌注固定后取含有海馬結(jié)構(gòu)的2～3 mm厚冠狀切面腦塊，然后用2.5%戊二醛進(jìn)行固定。取皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)1 mm3組織各3塊，1%鋨酸固定2 h，丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋0.1%醋酸鈾和3%檸檬酸鉛雙重電子染色5 min，H-600透射式電子顯徽鏡下進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察，每個(gè)組織塊觀察3個(gè)銅網(wǎng)，選擇病灶部位照像并病理分析，記錄海馬神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié) 果

2.1 杏仁核耐藥性癲癇模型制作 用SD大鼠60只制作模型，成功點(diǎn)燃31只，點(diǎn)燃成功率為51.6%。在點(diǎn)燃后僅有1只大鼠出現(xiàn)自發(fā)性發(fā)作，自發(fā)性發(fā)作率為3.33%。平均每只大鼠點(diǎn)燃約需6～10 w，31只完全點(diǎn)燃耗時(shí)約15 w。將31只癲癇大鼠進(jìn)行耐藥篩選，2只死亡，29只中有10只對(duì)PHT耐藥，再進(jìn)行PB的篩選，其中有2只是對(duì)PB敏感的，對(duì)兩種藥物耐藥的有8只，ADT值不定不能分組5只，藥物敏感大鼠16只，耐藥率為27.58%。每只癲癇大鼠要經(jīng)過6 w的耐藥性篩選，篩選出這8只耐藥性癲癇大鼠耗時(shí)約20 w，近5 m。

2.2 匹羅卡品耐藥性癲癇模型制作 用SD大鼠60只制作模型，有自發(fā)性發(fā)作29只，成功率為48.33%，植入杏仁核電極后死亡3只，癲癇自發(fā)性發(fā)作率為100%。模型制作分為4批，每次15只，每周制作一批。約耗時(shí)6 w，共有26只大鼠進(jìn)行耐藥篩選過程，其中對(duì)PB耐藥有15只，再行CBZ藥物篩選，其中3只對(duì)CBZ敏感，剩下的12只既對(duì)PB耐藥也對(duì)CBZ耐藥，共篩選出耐藥模型大鼠12只，不能分組3只，藥物敏感癲癇大鼠11只，耐藥率為46.15%，而杏仁核模型為27.58%。 可見匹羅卡品模型更易導(dǎo)致耐藥性癲癇模型。藥物篩選耗時(shí)4 w，制作匹羅卡品耐藥性癲癇模型約耗時(shí)10 w。

2.3 兩種模型的行為學(xué)對(duì)比 在癲癇發(fā)作的級(jí)別上，杏仁核模型發(fā)作Racine分級(jí)平均秩次為7.00;而匹羅卡平模型發(fā)作Racine 分級(jí)平均秩次為14.00(P=0.07)，兩種方法無顯著性差異,但匹羅卡品模型較杏仁核電刺激點(diǎn)燃模型癲癇發(fā)作持續(xù)的時(shí)間長，發(fā)作的頻率高(見表1)。

2.4 癲癇大鼠腦電圖變化 正常大鼠腦電圖波形頻率以5～10 Hz為主，波幅小于20 μV。杏仁核模型的癲癇發(fā)作時(shí)腦電圖頻率增加達(dá)到20～30 Hz，波幅增高達(dá)到80～90 μV；而匹羅卡品模型發(fā)作時(shí)的腦電圖則表現(xiàn)為頻率30 Hz以上，波幅100～1000 μV，以連續(xù)高波幅棘波、棘尖波或棘慢波、尖慢波發(fā)放為主(見圖1)。

2.5 耐藥性癲癇海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化 正常大鼠電鏡下神經(jīng)元結(jié)構(gòu)總體能觀察到豐富的細(xì)胞器，核膜完整的，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常。匹羅卡品敏感及耐藥模型的超微結(jié)構(gòu)的損傷均較杏仁核嚴(yán)重(見圖2)。

2.6 耐藥性癲癇患者海馬組織超微結(jié)構(gòu)變化 本課題組在臨床工作中收集了8例耐藥性癲癇患者的腦組織，這些患者是根據(jù)臨床表現(xiàn)、視頻腦電圖監(jiān)測(cè)及神經(jīng)影像學(xué)檢查確診為耐藥性顳葉癲癇的，通過多種的抗癲癇藥物長期不能控制癲癇的發(fā)作，行手術(shù)切除致癇灶，全部患者術(shù)中留取海馬、顳葉病灶腦組織作病理檢查，觀察顳葉癲癇患者病灶腦組織病理結(jié)構(gòu)變化。電鏡結(jié)果提示：部分髓鞘增厚、水腫，髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解紊亂，神經(jīng)元軸突水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞水腫、細(xì)胞器減少。與上述匹羅卡品耐藥性癲癇大鼠表現(xiàn)基本一致，提示匹羅卡品模型方法可靠易行(見圖3)。

表1 杏仁核慢點(diǎn)燃模型與匹羅卡品模型發(fā)作持續(xù)時(shí)間及頻率

與杏仁核點(diǎn)燃模型組比較*P<0.05，有顯著性差異。由上表可見，匹羅卡品癲癇模型發(fā)作持續(xù)的時(shí)間及發(fā)作的頻率均較杏仁核電刺激模型增加

圖1 杏仁核模型及匹羅卡品模型大鼠腦電圖變化(A.正常腦電圖，以正常的α波和β波為主；B.杏仁核模型大鼠腦電圖，頻率19 Hz，波幅在100 μV以下，以連續(xù)發(fā)放的尖波為主；C.匹羅卡品模型腦電圖，頻率30 Hz，波幅在100 μV以上)

3 討 論

杏仁核模型成功率51.6%，匹羅卡品模型為48.33%。但是杏仁核模型有自發(fā)性癲癇發(fā)作的大鼠僅有1只，為3.33%，而匹羅卡品模型都有自發(fā)性發(fā)作，自發(fā)率為100%。所不同的是杏仁核模型從刺激開始到大鼠出現(xiàn)行為上的癲癇發(fā)作需要6～8 w，有時(shí)長達(dá)2個(gè)多月也沒有發(fā)作，只有棄用，耗時(shí)較長，31只完全點(diǎn)燃耗時(shí)約15 w。且需每天刺激，在刺激時(shí)大鼠煩躁異常，容易抓脫電極或者顱內(nèi)感染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失??；而匹羅卡品模型，從注射藥物開始30 min內(nèi)即出現(xiàn)SE的表現(xiàn)，抽搐停止后2 w，若出現(xiàn)自發(fā)性癲癇發(fā)作，即為模型成功，模型制作相對(duì)簡便，29只制作成功的周期為6 w。模型成功后癲癇發(fā)作頻繁，癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間和發(fā)作頻率都較杏仁核模型明顯增多，自發(fā)性發(fā)作率高。但匹羅卡品模型的死亡率較高為26.7%，實(shí)驗(yàn)中死亡16只。

只有在普通癲癇模型的基礎(chǔ)上經(jīng)過作用機(jī)制不同的兩種抗癲癇藥物治療足夠時(shí)間，仍然無效的才能認(rèn)為是耐藥性癲癇模型。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)杏仁核和匹羅卡品模型，我們均用兩種作用機(jī)制不同的一線抗癲癇藥(PB、PHT或CBZ)進(jìn)行耐藥性癲癇的篩選，杏仁核模型選用的是PHT和PB，耗時(shí)6 w,而匹羅卡品模型選用的是PB和CBZ，耗時(shí)4 w，原因是PHT和CBZ作用機(jī)制是基本一致的鈉通道阻滯劑，而PHT由于在臨床中應(yīng)用副作用很大，已經(jīng)逐漸退出臨床使用，所以在試驗(yàn)過程中價(jià)格昂貴，購買困難。而CBZ目前廣泛的應(yīng)用于臨床，是國際抗癲癇協(xié)會(huì)推薦的一線抗癲癇藥物，目前廣泛用作耐藥性模型的篩選[13,14]。

我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杏仁核耐藥性癲癇耐藥率27.58%，匹羅卡品耐藥率為38.48%，篩選過程與Wang等使用馬桑內(nèi)酯點(diǎn)燃制作的耐藥性癲癇模型類似[14]，篩選結(jié)果與Bethmann K等的研究結(jié)果相似[13]。本研究結(jié)果表明，無論是電點(diǎn)燃模型還是化學(xué)模型篩選出來的耐藥性癲癇動(dòng)物均是客觀可靠的，但匹羅卡品模型耐藥率較杏仁核電刺激點(diǎn)燃模型耐藥率明顯升高，使用該模型制作耐藥顳葉癲癇模型成功率更高。耐藥性癲癇模型海馬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為核膜不完整、軸索變性水腫、線粒體變性，這些變化類似于Gao等近期發(fā)表的研究[15]，他們認(rèn)為線粒體超微結(jié)構(gòu)損傷與實(shí)驗(yàn)性顳葉癲癇的長期發(fā)作密切相關(guān)，而且線粒體易于受到癲癇發(fā)作的損害。我們的耐藥性顳葉癲癇患者海馬組織標(biāo)本提示髓鞘水腫、增厚、膜結(jié)構(gòu)松解紊亂，實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與此類似。上述研究結(jié)果從形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明了杏仁核點(diǎn)燃耐藥模型及匹羅卡品點(diǎn)燃耐藥模型的可靠性。

總之，兩種模型都是可靠的耐藥性顳葉癲癇的模型，杏仁核模型主要是對(duì)大鼠腦組織損傷小，能夠模擬人類癲癇發(fā)作過程，但制作過程復(fù)雜困難，耗時(shí)長，耐藥率低。而匹羅卡品模型制作簡便，自發(fā)率高，癲癇發(fā)作持續(xù)的時(shí)間及頻率高，超微結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，更利于耐藥性機(jī)制的研究。

圖2 杏仁核及匹羅卡品模型海馬超微結(jié)構(gòu)(電鏡×1500倍)。圖A～D為正常電鏡下神經(jīng)元結(jié)構(gòu)；B為杏仁核敏感組的海馬神經(jīng)元：神經(jīng)元形態(tài)有所改變，但核膜基本完整，可見線粒體腫脹，細(xì)胞器減少；E為匹羅卡品敏感組海馬神經(jīng)元，E的損傷較B更為嚴(yán)重，胞體濃縮變性，核皺縮變形，核膜有輕度內(nèi)陷，線粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹變性，胞漿淡染，核膜不規(guī)則；C為杏仁核耐藥組海馬神經(jīng)元，在B的基礎(chǔ)上可見部分髓鞘增厚、水腫，髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解紊亂，神經(jīng)元軸突水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞水腫；F為匹羅卡品耐藥組，在E的基礎(chǔ)上可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體脫落，游離核糖體解聚，胞質(zhì)中微絲增多， F的損傷較C更加嚴(yán)重。提示匹羅卡品耐藥模型的超微結(jié)構(gòu)的損傷較杏仁核嚴(yán)重

A和C提示髓鞘增厚、水腫，部分髓鞘板層結(jié)構(gòu)松解紊亂;B示神經(jīng)元軸突水腫，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞水腫、細(xì)胞器減少

圖3 耐藥性癲癇患者電鏡下腦組織超微結(jié)構(gòu)變化