王顯蘇 邵學(xué)東 張正文 任鳳山 王詠梅

1.山東省葡萄研究院/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術(shù)研究中心； 2.君頂酒莊有限公司

一、引言

近年來(lái)，我國(guó)的果酒產(chǎn)業(yè)獲得了快速的發(fā)展，并形成了一些特色果酒品牌。對(duì)于特色果酒來(lái)說，即是指具有較強(qiáng)地域特色的非葡萄發(fā)酵酒。在果酒釀造當(dāng)中，酵母是其中非常重要的一項(xiàng)因素，將直接對(duì)果酒的風(fēng)味、品質(zhì)以口感產(chǎn)生影響。在現(xiàn)今很多果酒釀制中，都是使用葡萄酒酵母發(fā)酵形成，而沒有使用特色果酒的專用酵母進(jìn)行釀制，并因此對(duì)果酒的口味以及未來(lái)產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生了影響。在果酒釀造中，對(duì)于優(yōu)質(zhì)酵母菌株的培育與篩選可以說是其核心技術(shù)內(nèi)容，目前，我國(guó)的很多研究人員也意識(shí)到了這一點(diǎn)，并積極的開展了對(duì)于特色果酒專用酵母的選育，獲得了較好的研究成果。

二、菌種分離篩選

在自然界當(dāng)中，酵母菌具有廣泛的分布特征，可以說，有酵母生長(zhǎng)繁殖的區(qū)域，都能夠進(jìn)行分離篩選處理。在傳統(tǒng)果酒酵母選育中，主要是在酵母菌活躍存在的區(qū)域進(jìn)行分離篩選，主要包括有：第一，成熟水果果皮。在果實(shí)的表皮位置，具有大量酵母菌的附著。從果皮當(dāng)中即能夠?qū)崿F(xiàn)酵母菌的篩選。同時(shí)，鮮榨果汁也是對(duì)果酒酵母進(jìn)行篩選的優(yōu)良培養(yǎng)基，在果皮表面位置，所具有的酵母在果汁發(fā)酵環(huán)境方面具有較好的適應(yīng)性，有較大的幾率從中篩選出有用菌株；第二，果園土壤空氣。在果園附近的空氣、土壤當(dāng)中，也具有大量的酵母菌，從中經(jīng)過篩選，即能夠獲得具有優(yōu)良品質(zhì)的酵母菌種；第三，發(fā)酵醪液。在發(fā)酵醪液中篩選酵母時(shí)，具有較強(qiáng)的針對(duì)性。這是因在發(fā)酵醪中，酵母菌可以看做已經(jīng)經(jīng)過了發(fā)酵初篩。在實(shí)際分離篩選中，需要能夠根據(jù)酵母群消長(zhǎng)規(guī)律以及實(shí)際目的做好恰當(dāng)取樣時(shí)期的選擇[1]。

三、酵母菌種品質(zhì)改良

對(duì)于從自然界當(dāng)中經(jīng)過篩選獲得的酵母菌種來(lái)說，其具有較低的自發(fā)突變率，需要進(jìn)行富集培養(yǎng)，且在特性方面存在不夠理想的情況，無(wú)法直接在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用，需要在此基礎(chǔ)上對(duì)其品質(zhì)做進(jìn)一步改良，以此對(duì)工業(yè)化大生產(chǎn)相關(guān)要求進(jìn)行滿足。在現(xiàn)今科技不斷發(fā)展的過程中，也逐漸形成了較多酵母選育技術(shù)，其主要包括有：第一，誘變育種。即通過化學(xué)、物理因素獲得誘變菌株，這也是對(duì)酵母菌株進(jìn)行直接改良的方式，目前應(yīng)用較多的有γ射線、紫外線以及X射線等[2]；第二，雜交。在該方式中，即是對(duì)酵母生活史進(jìn)行利用，通過其相反交配型細(xì)胞以及不同遺傳特性形成的雙倍體進(jìn)行的一種方式。通過該育種方式的應(yīng)用，能夠?qū)翟陂L(zhǎng)時(shí)間誘變后所出現(xiàn)的難以提升產(chǎn)量性狀障礙進(jìn)行消除，也是一種十分有效的育種方式；第三，原生質(zhì)體融合。該技術(shù)又稱作細(xì)胞融合技術(shù)，即對(duì)于兩種不同親株，在通過酶法去壁處理后所獲得的原生質(zhì)體，在將其放置在高滲溶液、在經(jīng)過融合及促融后使相互間拘泥、形成細(xì)胞融合，在使基因重組后對(duì)具有優(yōu)良親本性能的菌株進(jìn)行獲得。同其余技術(shù)相比，該技術(shù)具有較高的雜交頻率以及完整的遺傳物質(zhì)，受到致育、結(jié)合限制較小，能夠使兩株以上親株同時(shí)參與到融合當(dāng)中，在菌株品質(zhì)、產(chǎn)量的提升方面具有較大的潛力，在菌種優(yōu)良性能的整合方面體現(xiàn)出了較好的應(yīng)用價(jià)值[3]；第四，基因工程。在該方式中，即根據(jù)人的意志將外源基因在體外嵌入到載體DNA，之后將其導(dǎo)入到宿主細(xì)胞當(dāng)中，對(duì)能夠外源基因表達(dá)、能復(fù)制的克隆進(jìn)行形成。通過該方式的應(yīng)用，即能夠從生物體內(nèi)對(duì)需要表達(dá)的人工合成DNA片段以及基因進(jìn)行提取，在將其導(dǎo)入到載體、轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞后重新組合遺傳物質(zhì)，以此對(duì)釀酒酵母的改良目標(biāo)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)；第五，離子束注入。這是一種材料表面處理技術(shù)，具有動(dòng)量沉淀、電荷中和交換以及能量沉積作用。在實(shí)際應(yīng)用中，能夠在注入離子束的情況下對(duì)生物體形成明顯的誘變，也是我國(guó)目前具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的遺傳育種定向方式。同傳統(tǒng)化學(xué)誘變劑以及輻射方式下相比，該方式在應(yīng)用中具有遺傳穩(wěn)定、突變率高、突變譜寬以及容易獲得理想菌株的優(yōu)點(diǎn)，除了同普通輻射相比能夠引起DNA鏈斷裂外，也將因能量、電荷以及質(zhì)量因子協(xié)同使大量受體原子發(fā)生移位以及重組，對(duì)新的分子基因與結(jié)構(gòu)進(jìn)行形成，并形成豐富的基因突變，是一種較為理想的菌種選育方式；第六，激光誘變。激光在對(duì)酵母菌照射后，即可以通過光、電、熱、電磁效應(yīng)以及壓力綜合作用對(duì)酵母菌產(chǎn)生影響，使細(xì)胞RNA或者DNA發(fā)生變化，使酶出現(xiàn)鈍化或者激活的情況，導(dǎo)致細(xì)胞代謝活動(dòng)改變以及細(xì)胞分裂情況。激光在同其余誘變劑進(jìn)行復(fù)合處理后，在誘變效果方面也具有較好的表現(xiàn)。同其余方式相比，激光誘變方式具有安全、變異率高、操作簡(jiǎn)單以及輻射損傷輕的優(yōu)點(diǎn)；第七，高壓靜電反應(yīng)近年來(lái)，靜電生物效應(yīng)具有較多的研究，在微生物領(lǐng)域中應(yīng)用較多，對(duì)于生物有機(jī)體細(xì)胞能夠激活、鈍化酶、使細(xì)胞DNA染色體發(fā)生畸變情況，在應(yīng)用于釀酒酵母菌的誘變育種展現(xiàn)了新的前景[4]。

四、特色果酒專用酵母研究進(jìn)展

（一）梨果果酒

梨果包括有琵琶、蘋果、山楂以及梨等水果，其中，梨雖然不具有特殊果香，但所具有的較高糖含量以及出汁率對(duì)很多研究人員進(jìn)行了吸引。近年來(lái)，也有很多研究者在梨果方面進(jìn)行了酵母的篩選，并從梨中分離到約6株酵母 。其中，有研究人員從其自然發(fā)酵液當(dāng)中對(duì)1個(gè)酵母菌株進(jìn)行分離，該菌株在梨汁當(dāng)中具有較強(qiáng)的發(fā)酵力，具有較高的產(chǎn)酒度，產(chǎn)香好且殘?zhí)禽^低，能夠應(yīng)用為獨(dú)立的發(fā)酵菌株。也有研究人員從腰果梨和果樹根部土壤中對(duì)65株酵母菌進(jìn)行了分離，在經(jīng)過篩選后對(duì)最優(yōu)菌株進(jìn)行了確定，具有耐300 mg/L二氧化硫的特點(diǎn)。也有研究者將梨園土壤以及梨果皮為分離源，對(duì)2株特征酵母進(jìn)行分離，包括有東方伊莎酵母以及釀酒酵母，在將兩者為出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)行原生質(zhì)融合育種處理，最終對(duì)優(yōu)良融合子DJ02進(jìn)行獲得，該均值具有較好的產(chǎn)香能力以及較強(qiáng)的發(fā)酵能力，是梨酒釀造中最為適合的酵母菌株[5]。

（二）核果果酒

核果包括有胡桃、桃、杏、楊梅等，其中，楊梅是近年來(lái)具有較多酵母分離的核果類型。目前，有研究人員從楊梅發(fā)酵醪以及楊梅果周邊環(huán)境中對(duì)4個(gè)菌株進(jìn)行篩選，這部分均值在色澤、風(fēng)味以及產(chǎn)氣性能等方面都具有較好的表現(xiàn)。同時(shí)，也從青梅中對(duì)優(yōu)良均值進(jìn)行篩選，能夠?qū)?1.9%酒精度的青梅果酒進(jìn)行生成，但在酒產(chǎn)品性能方面還存在不足，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。也有研究者從冬棗的發(fā)酵液中對(duì)釀酒酵母進(jìn)行篩選，在對(duì)其進(jìn)行紫外誘變育種研究后，對(duì)具有優(yōu)良特點(diǎn)的冬棗果酒專用酵母進(jìn)行獲得。也有研究人員從成熟的桃表面對(duì)1株具有較強(qiáng)產(chǎn)酒產(chǎn)香能力的酵母進(jìn)行選育[6]。

（三）柑果果酒

柑果包括有桔、橙以及柚等。對(duì)于這部分果實(shí)來(lái)說，其具有較高的含糖量，具有明顯的特征風(fēng)味。近年來(lái)，也具有該類果實(shí)果酒釀造相關(guān)的報(bào)道。有研究人員從腐爛的桔子當(dāng)中對(duì)35株釀酒酵母進(jìn)行分離，從中對(duì)3株具有較好發(fā)酵性能的菌株進(jìn)行篩選。其中，F(xiàn)16菌株在酒品質(zhì)以及發(fā)酵性能方面具有最好的表現(xiàn)，能夠較好的應(yīng)用為桔子酒專用菌株進(jìn)行選育。也有研究者從臍橙果園土壤以及果汁自然發(fā)酵液作為分離源，對(duì)1株優(yōu)良酵母進(jìn)行分離，該菌株具有發(fā)酵過程緩和、產(chǎn)香好以及起酵速度快的特點(diǎn)，能夠作為臍橙果酒的專用發(fā)酵酵母進(jìn)行應(yīng)用。還有研究人員從甜橙、土壤果實(shí)的表面位置對(duì)138株酵母菌進(jìn)行分離，在經(jīng)過4級(jí)篩選后，對(duì)2株具有較好發(fā)酵性能的酵母進(jìn)行獲得，經(jīng)過鑒定為有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)[7]。

（四）漿果果酒

漿果是多汁肉質(zhì)單果的統(tǒng)稱，包含有藍(lán)莓、葡萄以及獼猴桃等，都屬于多汁肉質(zhì)果實(shí)，非常適合應(yīng)用在果酒的釀造當(dāng)中。在該類果酒中，其主要產(chǎn)品有：第一，藍(lán)莓。藍(lán)莓是同葡萄相比具有接近農(nóng)藝形狀的漿果類型，在出汁率以及含糖量方面具有較好的表現(xiàn)，同釀酒葡萄具有類似的果實(shí)大小，非常適合應(yīng)用在果酒的釀造當(dāng)中。目前，有研究人員從藍(lán)莓葉、藍(lán)莓果園土壤以及成熟果汁中對(duì)最優(yōu)菌株進(jìn)行了篩選，經(jīng)過鑒定為釀酒酵母，該菌株具有加強(qiáng)的發(fā)酵能力以及加快的起酵特點(diǎn)，在風(fēng)味以及香氣方面具有較好的表現(xiàn)。也有研究人員從藍(lán)莓自然發(fā)酵汁中對(duì)4株具有較好發(fā)酵性能的酵母菌，這4株菌具有平穩(wěn)的發(fā)酵特點(diǎn)，在果香以及酒香配比方面較為恰當(dāng)，具有適中的酸味，具有濃郁的酒味。有研究者從藍(lán)莓自然發(fā)酵醪以及成熟果皮中經(jīng)過分離純化獲得73株野生菌株，在經(jīng)過逐級(jí)篩選后，對(duì)一株具有較高乙醇耐受性、較好二氧化硫耐受性以及較優(yōu)發(fā)酵性能的菌株進(jìn)行獲得，在經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育樹以及序列鑒定后，確定為釀酒酵母。同時(shí)，也對(duì)該菌株的最佳澄清劑、果酒穩(wěn)定性以及發(fā)酵工藝參數(shù)等進(jìn)行了深入的研究[8]；第二，獼猴桃。是具有豐富維生素E、維生素K、維生素C以及類胡蘿卜素等成分的漿果。目前，很多研究人員也對(duì)其進(jìn)行了研究，從獼猴桃皮中對(duì)2株酵母進(jìn)行分離。其中一株具有較強(qiáng)的發(fā)酵活力，適合應(yīng)用為獼猴桃果酒發(fā)酵主發(fā)酵菌株。另一株在發(fā)酵后獲得的果酒具有獨(dú)特的香氣，具有較高的香氣組分，適合應(yīng)用為果酒發(fā)酵輔助菌株。也有研究人員從獼猴桃中對(duì)1株具有濃郁果香酒香、較好發(fā)酵能力的菌株進(jìn)行篩選，經(jīng)鑒定為庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）[9]；第三，桑葚。這也是近年來(lái)在酵母選育方面具有較多研究的果品類型。有研究人員從成熟桑葚桑葉、果實(shí)以及土壤作為分離源，經(jīng)過篩選對(duì)1株優(yōu)良菌株進(jìn)行獲得，具有較快的起酵能力，對(duì)高濃度二氧化硫以及酒精具有較高的耐受度。也有研究人員將桑果園土壤以及果汁自然發(fā)酵液為分離源，經(jīng)過分離對(duì)1株優(yōu)良均值進(jìn)行獲得，該菌株具有較快的起酵速度，整個(gè)過程具有緩和的特點(diǎn)，通過1t放大試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該均值能夠作為桑葚果酒生產(chǎn)酵母進(jìn)行應(yīng)用[10]。

五、結(jié)束語(yǔ)

在上文中，我們對(duì)我國(guó)特色果酒專用酵母的研究進(jìn)展進(jìn)行了一定的研究。在未來(lái)工作中，需要能夠在現(xiàn)有基礎(chǔ)上進(jìn)一步做好優(yōu)良品質(zhì)果酒酵母的研究與開發(fā)，在實(shí)現(xiàn)果酒生產(chǎn)工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上獲得更好的質(zhì)量與產(chǎn)量，為我國(guó)果酒產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用。