江明禮，莫 非＊，渠 巍，孫朝琴，羅昭遜，張 姝，吳銀杰

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州貴陽 550004;2.貴陽市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州貴陽 550003)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)是人類最常見的慢性感染致病菌之一，多在胃黏膜上定植，可侵入宿主防御系統(tǒng)，通過產(chǎn)生毒素及誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等對(duì)人體造成傷害［1－2］。Toll樣受體(Tolllike receptors，TLRs)是研究最為廣泛的模式識(shí)別受體之一，在天然免疫防御中起著重要作用［3－4］。前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，H.pylori相關(guān)性胃炎模型大鼠經(jīng)苗藥頭花蓼治療后，胃部炎癥減輕，胃黏膜TLR4蛋白表達(dá)下調(diào)［5］，提示該藥具有抗炎抑菌，調(diào)節(jié)固有性免疫的作用，但其抗H.pylori胃炎的作用機(jī)制仍尚未明了。為進(jìn)一步明確體內(nèi)頭花蓼與TLRs信號(hào)通路的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)采用人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)與H.pylori共培養(yǎng)建立感染H.pylori的胃炎細(xì)胞模型并觀察其形態(tài)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot法觀察頭花蓼對(duì) TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及下游因子 MyD88、TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討頭花蓼對(duì)TLRs信號(hào)通路的影響，為頭花蓼抗H.pylori治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、藥物及試劑

人永生化胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1，上海腫瘤研究所)，H.pyloriATCC 700392(中國疾病控制中心傳染病所張建中教授惠贈(zèng));苗藥頭花蓼浸膏(粉)，生藥量為9.17 g/g，浙江眾益制藥有限公司提供，批號(hào)14196;Trizol購自Invitrogen公司，熒光定量PCR試劑盒、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara公司，組織蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、rabbit-anti-TLR2、rabbit-anti-TLR4、rabbit-anti-TLR9、rabbit-anti-TRAF6、rabbit-anti-GAPDH 均購自萬類生物有限公司，abbit-anti-MyD88購自CST公司，rabbit-anti-TLR5購自Bioworld公司，HRP標(biāo)記抗羊抗兔IgG抗體購于杭州聯(lián)科生物公司。熒光定量PCR儀(德國ROCHE)，Western Blot電泳儀及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori的培養(yǎng) 按照文獻(xiàn)［6］將凍存的H.pyloriATCC 700392室溫溶解后，轉(zhuǎn)移至哥倫比亞血平皿內(nèi)，置于三氣培養(yǎng)箱(85%N2、10%CO2、5%O2，溫度37℃、相對(duì)濕度95%)穩(wěn)定培養(yǎng)3代備用。

1.2.2 GES-1細(xì)胞的培養(yǎng) 從液氮中取出GES-1細(xì)胞于37℃水浴箱解凍后，轉(zhuǎn)移至含有9 mL DMEM培養(yǎng)基的10 mL離心管中，吹打混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入2 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸;將重懸的細(xì)胞移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入3 mL上述培養(yǎng)基中，在5%CO2、溫度37℃、相對(duì)濕度95%培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)3代備用。

1.2.3 細(xì)胞模型的復(fù)制及分組 按照課題組前期研究方法［7］將GES-1細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組及藥物組，模型組和藥物組H.pylori細(xì)菌與GES-1細(xì)胞以100∶1的比例共培養(yǎng)12 h建立感染H.pylori的胃炎細(xì)胞模型。無血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)4 h后，藥物組給予頭花蓼干預(yù)48 h，空白組、模型組給予等量培養(yǎng)基，各組細(xì)胞均于5%CO2、溫度37℃、相對(duì)濕度90%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.4 顯微鏡檢查 模型復(fù)制成功、給予相應(yīng)處理48 h后，將各組細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察并采圖。同時(shí)制作細(xì)胞爬片并采用特制固定液(取自重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室)固定細(xì)胞，置于4℃冰箱內(nèi)固定2 d，送至重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院電鏡室進(jìn)行掃描及投射電子顯微鏡觀察。

1.2.5 TLRs及相關(guān)因子mRNA表達(dá)檢測(cè) 在給予相應(yīng)處理48 h后，Omega試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，用酶標(biāo)儀對(duì)提取的總RNA進(jìn)行測(cè)定。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ驭?actin作為內(nèi)參基因，采用primer 5設(shè)計(jì)PTEN、AKT擴(kuò)增引物(見表1)。20μL反應(yīng)體系包括2.0μL DNA模版，0.8μL上、下游引物，10 μL SYBR Premix ExTaqTMII，6.4 μL滅菌ddH2O。反應(yīng)條件為95℃ 30 s，95℃ 5 s，56 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。各組數(shù)據(jù)采用 2－ΔΔCT法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行分析。

表1 PCR擴(kuò)增引物基因序列Tab.1 The sequences of the primers for real-time PCR

1.2.6 TLRs及相關(guān)因子蛋白表達(dá)檢測(cè) 在給予各組細(xì)胞相應(yīng)處理48 h后，提取蛋白，配置10%SDS-PAGE凝膠，行電泳分離(上樣量為20μg/孔)，將電泳物轉(zhuǎn)移至0.45μm PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫?fù)u封閉2 h，洗膜后加入抗 TLR2、TLR4、TLR9、TRAF6 抗體(稀釋比例 1∶500) 、TLR5、MyD88抗體(稀釋比例1∶1 000)4℃孵育過夜。第2天洗膜后加入熒光二抗(稀釋比例1∶10 000)，室溫孵育1 h后加入顯色液。采用自動(dòng)曝光儀曝光并采圖，后用Image J灰度掃描軟件進(jìn)行灰度掃描。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett-t進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 感染H.pylori的GES-1胃炎細(xì)胞形態(tài)

2.1.1 光學(xué)顯微鏡 倒置顯微鏡下，見空白組背底干凈，細(xì)胞外觀飽滿呈梭形，表面光滑，附著顆粒物質(zhì)較少;模型組多數(shù)細(xì)胞瘦長(zhǎng)，表面不光滑，顆粒物質(zhì)明顯較空白組增多;藥物作用后，細(xì)胞狀態(tài)有顯著改善，背底清晰，細(xì)胞邊緣較模型組整齊，顆粒物質(zhì)明顯變少，見圖1。

2.1.2 掃描電鏡 掃描電鏡下對(duì)空白組、模型組及藥物組GES-1細(xì)胞進(jìn)行觀察，見空白組細(xì)胞形態(tài)豐滿，表面光滑，外泌體較少;模型組細(xì)胞多瘦長(zhǎng)，可見點(diǎn)狀或片狀物質(zhì)黏附于表面;藥物干預(yù)后，藥物組細(xì)胞較模型組外泌體減少，顆粒物質(zhì)較少，邊緣趨于整齊。見圖2。

圖1 光學(xué)顯微鏡下各組GES-1細(xì)胞形態(tài)(200×)Fig.1 Morphology of GES-1 gastritis cells in each group under optical microscope

圖2 掃描電鏡下各組GES-1細(xì)胞形態(tài)(600×)Fig.2 Morphology of GES-1 gastritis cells in each group under scanning electron microscope

2.1.3 透射電鏡 透射電鏡下可見空白組細(xì)胞膜表面絨毛層均勻整齊，整體形態(tài)飽滿，細(xì)胞器形態(tài)正常;而模型組細(xì)胞膜表面絨毛層疏松，細(xì)胞器皺縮，自噬小體減少;藥物組細(xì)胞較模型組背底清晰整潔，細(xì)胞形態(tài)大體完整，細(xì)胞絨毛緊貼細(xì)胞膜，細(xì)胞器趨于正常，核膜形態(tài)較好，見圖3。

圖3 透射電鏡下各組GES-1細(xì)胞形態(tài)(5 000×)Fig.3 Morphology of GES-1 gastritis cells in each group under transmission electron microscope

2.2 頭花蓼對(duì)感染H.pylori的GES-1細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 mRNA 水平的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，H.pylori感染GES-1細(xì)胞后，TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及MyD88、TRAF6 mRNA水平較空白組上調(diào)(P＜0.05);與模型組相比，頭花蓼干預(yù)后TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及MyD88、TRAF6 mRNA水平下調(diào) (P＜0.05)，提示頭花蓼可下調(diào)TLRs信號(hào)通路mRNA表達(dá)水平改善幽門螺桿菌胃炎炎癥反應(yīng)。見表2。

表2 頭花蓼對(duì)TLR2、TLR4、TLR5、TLR9及MyD88、TRAF6 mRNA水平的影響(±s)Tab.2 Effects of Polygonum capitatum on TLR2，TLR4，TLR5，TLR9，MyD88 and TRAF6 mRNA levels

表2 頭花蓼對(duì)TLR2、TLR4、TLR5、TLR9及MyD88、TRAF6 mRNA水平的影響(±s)Tab.2 Effects of Polygonum capitatum on TLR2，TLR4，TLR5，TLR9，MyD88 and TRAF6 mRNA levels

(1)與空白組比較，P＜0.05;(2)與模型組比較，P＜0.05

基因 mRNA表達(dá)水平空白組 模型組 頭花蓼組TLR2 1.064±0.059 7.329±0.204(1)5.075±0.034(2)TLR4 1.042±0.044 1.888±0.009(1)1.141±0.049(2)TLR5 0.940±0.052 1.622±0.028(1)1.159±0.047(2)TLR9 0.960±0.036 4.221±0.355(1)1.198±0.075(2)MyD88 1.037±0.076 3.352±0.144(1)1.823±0.135(2)TRAF6 0.995±0.028 3.443±0.020(1)1.633±0.108(2)

2.3 頭花蓼對(duì)感染H.pylori的GES-1細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果顯示，模型復(fù)制成功后，模型組 TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 較空白組上調(diào)(P＜0.05);與模型組相比，頭花蓼組TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6 下調(diào)(P＜0.05)。提示頭花蓼下調(diào)TLRs蛋白表達(dá)量，抑制下游炎癥因子的激活，從而減輕炎癥反應(yīng)。見圖4。

3 討論

H.pylori是目前公認(rèn)的能引起相關(guān)性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等的主要病因［8－9］，作為人類消化系統(tǒng)最常見的致病菌和模式病原菌之一，當(dāng)它進(jìn)入機(jī)體后可引起炎癥和免疫反應(yīng)失衡，人胃黏膜固有免疫及獲得性免疫會(huì)發(fā)生異常。Toll樣受體是目前研究最為廣泛的模式識(shí)別受體，可通過識(shí)別并結(jié)合微生物的病原相關(guān)分子模式，進(jìn)而啟動(dòng)自身固有免疫系統(tǒng)來對(duì)外來抗原進(jìn)行直接清除。有研究表明，TLRs與H.pylori致病密切相關(guān)［10－11］，胃黏膜上皮細(xì)胞是H.pylori與宿主之間的第一接觸點(diǎn)，而TLRs作為細(xì)胞中重要的病原模式識(shí)別受體通過識(shí)別微生物及其相關(guān)產(chǎn)物啟動(dòng)機(jī)體內(nèi)免疫系統(tǒng)，在H.pylori胃炎致病過程中作用中發(fā)揮重要作用。

圖4 頭花蓼對(duì)感染H.pylori的GES-1細(xì)胞TLR2、TLR4、TLR5、TLR9 及 MyD88、TRAF6蛋白水平的影響Fig.4 Effects of Polygonum capitatum on the protein levels of TLR2，TLR4，TLR5，TLR9，MyD88 and TRAF6 in GES-1 cells infected with H.pylori

苗藥頭花蓼是貴州傳統(tǒng)中草藥，具有清熱解毒抗菌的功效［12］。課題前期研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)H.pylori相關(guān)性胃炎具有良好的抗炎效果;且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)H.pylori感染后大鼠胃黏膜TLR4 mRNA表達(dá)升高，而苗藥頭花蓼可下調(diào)TLR4 mRNA的表達(dá)水平，推測(cè)頭花蓼可能通過調(diào)控TLRs信號(hào)通路改善H.pylori胃炎。故本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建感染H.pylori胃炎細(xì)胞模型觀察頭花蓼改善H.pylori胃炎的機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)H.pylori感染后GES-1胃炎細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下背底模糊，整體較瘦長(zhǎng)，表面粗糙，顆粒物質(zhì)明顯增多;掃描電子顯微鏡觀察，可見GES-1胃炎細(xì)胞形態(tài)各異，外泌體增多，有大量顆粒物質(zhì)附著，推測(cè)H.pylori黏附定植于GES-1細(xì)胞表面，菌體及相關(guān)毒性物引起細(xì)胞產(chǎn)生病理改變;進(jìn)一步使用透射電鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜表面絨毛層疏松，細(xì)胞器皺縮，偽足腫脹，自噬小體減少，提示H.pylori的感染會(huì)引起細(xì)胞整體及微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)的相應(yīng)改變。

眾多研究表明，中藥材可通過抑制Toll樣受體的表達(dá)，進(jìn)而控制病情的發(fā)展。李思漢等［13］通過對(duì)大鼠慢性萎縮性胃炎的研究，發(fā)現(xiàn)健脾清化中藥復(fù)方可有效阻斷TLR4信號(hào)通路的持續(xù)活化，并可使造模成功的大鼠胃黏膜恢復(fù)正常。本研究結(jié)果顯示，H.pylori感染 GES-1后，細(xì)胞 TLR2、TLR4、TLR5、TLR9和下游因子 MyD88、TRAF6 mRNA 及蛋白水平均相應(yīng)升高，此與王小娟［14］、Schmausser B［15］、盧震亞［16］的研究結(jié)果相符。該結(jié)果證實(shí)，經(jīng)H.pylori感染后，菌體及相關(guān)病原模式分子，如脂多糖、鞭毛、DNA片段等刺激相應(yīng)模式識(shí)別受體，啟動(dòng)細(xì)胞固有免疫系統(tǒng)，激活下游炎癥通路，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在使用頭花蓼治療后，TLR2、TLR4、TLR5、TLR9和下游因子 MyD88、TRAF6 mRNA 及蛋白水平明顯降低，且對(duì)TLR5的作用最為顯著。推測(cè)頭花蓼可能是通過抑制TLRs基因轉(zhuǎn)錄，抑制TLRs蛋白表達(dá)，從而抑制下游炎癥因子的激活和釋放，從而達(dá)到改善幽門螺桿菌胃炎的目的。

綜上，經(jīng)H.pylori感染后，GES-1胃炎細(xì)胞中TLRs通路因子表達(dá)明顯升高，說明H.pylori可激活TLRs通路并引發(fā)炎癥效應(yīng)。而頭花蓼作用后，TLRs通路及其相關(guān)因子表達(dá)有所下調(diào)，其中TLR5的作用較為顯著。故本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了苗藥頭花蓼可通過干預(yù)TLRs通路來調(diào)節(jié)H.pylori胃炎的發(fā)生發(fā)展，為臨床治療胃炎提供新的思路和理論依據(jù)。