賈建平,孫曉慧
(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院,遼寧沈陽 110042)
喉鱗狀細(xì)胞癌源于喉部黏膜上皮,是第二常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌[1]。目前,世界喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率逐漸增加,尤其在年輕人中呈上升趨勢(shì)[2]。喉部的特殊解剖結(jié)構(gòu)使得喉鱗狀細(xì)胞癌極易發(fā)生局部侵襲和頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[3],導(dǎo)致患者疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后不良。食管癌相關(guān)基因4((ECRG4)是一種腫瘤候選抑制基因,在食管鱗癌、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)[4-6],有報(bào)道其并可抑制頭頸鱗癌[7]、肝癌[8]的增殖、遷移和侵襲,還可抑制喉鱗癌細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9],但其機(jī)制尚不清楚。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞從有極性不能移動(dòng)的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞過程,細(xì)胞發(fā)生EMT后上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)、EMT間質(zhì)標(biāo)志物 N-cadherin、Vinmentin表達(dá)上調(diào),遷移和侵襲能力增加。本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)探究ECRG4對(duì)Hep-2細(xì)胞EMT發(fā)生、遷移和侵襲的影響及分子機(jī)制,以期闡明喉癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,提高喉癌的生存期和治愈率。
胎牛血清購自以色列Biological Industries(BI)公司,DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco,胰酶購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購自美國Invitrogen,TRIpure總 RNA提取試劑、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶均購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司,SYBR Green購自北京索萊寶科技有限公司,結(jié)晶紫購自美國Amresco公司,Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECRG4抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin D1抗體、Vinmentin 抗體、Snail抗體、NF-κB p65 抗體均購自沈陽萬類生物科技有限公司。
人喉癌細(xì)胞Hep-2及pcDNA3.1載體均購自萬類生物科技有限公司。Hep-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將全長(zhǎng)野生型ECRG4 CDS序列克隆入pcDNA3.1載體,構(gòu)建ECRG4過表達(dá)載體(ECRG4-pcDNA3.1),基因測(cè)序證明載體構(gòu)建成功。根據(jù)Lipofectamine2000操作說明轉(zhuǎn)染ECRG4-pcDNA3.1質(zhì)粒(ECRG4組)或空載體質(zhì)粒(Vector組),并設(shè)立未轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞組(Control組)。
利用總RNA提取試劑及cDNA合成試劑提取細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄至cDNA,放入ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x(BIONEER,韓國)進(jìn)行熒光定量反應(yīng),采用2-ΔΔCT法對(duì)ECRG4 mRNA進(jìn)行定量分析。ECRG4基因引物序列如下,ECRG4-F為5'-TGACATCACCTATTGGCTTA-3',ECRG4-R 為 5'-GAAT CGCTATTTGCTTCTTG-3';內(nèi)參基因 β-actin-F為5'-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3',β-actin-R為5'-CTGTCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3。
實(shí)驗(yàn)前將培養(yǎng)基換為無血清培養(yǎng)基并加入1 mg/L的絲裂霉素C處理1 h,利用200μL pipette tip造成細(xì)胞劃痕,用無血清培養(yǎng)基清洗細(xì)胞表面1次,顯微鏡下觀察并按組拍照,記錄照片中細(xì)胞的位置,記為0 h,并換用無血清培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24 h進(jìn)行再次拍照記錄,記為24 h,計(jì)算細(xì)胞遷移距離。
胰酶消化收集細(xì)胞,分別將200μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室(細(xì)胞量5×103/孔),下室加入含20% 胎牛血清的培養(yǎng)液800μL,置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。甲醛固定,結(jié)晶紫染色,在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至微孔膜下層5個(gè)視野的細(xì)胞,取均數(shù)。
胰酶消化收集細(xì)胞,分別將200μL細(xì)胞懸液加入預(yù)先鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室(細(xì)胞量2×104/孔),下室加入含20% 胎牛血清的培養(yǎng)液800μL。置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h,甲醛固定,結(jié)晶紫染色,在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲至微孔膜下層5個(gè)視野的細(xì)胞,取均數(shù)。
RIPA裂解法提取樣本總蛋白及細(xì)胞漿和細(xì)胞核蛋白,采用 BCA法對(duì)蛋白進(jìn)行定量,取20~40μg蛋白上樣,行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)印至PVDF膜,經(jīng)5%(M/V)脫脂奶粉封閉1 h后,加入適當(dāng)稀釋的 ECRG4、Snail、E-cadherin、N-cadherin、Vinmentin、NF-κB p65抗體4℃過夜孵育,TBST緩沖液清洗PVDF膜,放入二抗羊抗小鼠IgG-HRP(1∶5 000)工作液中37℃孵育45 min,ECL底物發(fā)光,采用凝膠圖象處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶光密度值。
采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
ECRG4組Hep-2細(xì)胞中ECRG4 mRNA的表達(dá)較Control組及Vector組顯著上調(diào)(P<0.01),見圖 1A;ECRG4蛋白在 Control組及 Vector組Hep-2細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá),ECRG4組Hep-2細(xì)胞中ECRG4蛋白表達(dá)較Control組及Vector組顯著上調(diào)(P<0.01),與mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致,見圖1B。
圖1 各組Hep-2細(xì)胞中ECRG4基因和蛋白表達(dá)水平Fig.1 Expression of ECRG4 gene and protein in Hep-2 cells
細(xì)胞劃痕檢測(cè)Hep-2細(xì)胞遷移能力,結(jié)果顯示ECRG4組細(xì)胞遷移率較Control組及Vector組顯著下降(P<0.01),見圖2A;Tanswell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hep-2細(xì)胞遷移,結(jié)果顯示ECRG4組與Control組及Vector組相比細(xì)胞遷移數(shù)顯著減少(P<0.01),見圖2B。
Tanswell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hep-2細(xì)胞侵襲能力,結(jié)果顯示ECRG4組Hep-2細(xì)胞侵襲數(shù)較Control組及Vector組顯著減少(P<0.01),見圖3。
為了觀察ECRG4對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響,通過Western Blot檢測(cè)各組Hep-2細(xì)胞細(xì)胞核與胞漿中NF-κB p65蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示ECRG4組Hep-2細(xì)胞胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較Control組及 Vector組顯著下調(diào)(P<0.01),見圖4A;ECRG4組Hep-2細(xì)胞胞漿中NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較Control組及Vector組顯著上調(diào),見圖4B。
圖2 各組Hep-2細(xì)胞遷移能力Fig.2 Migration ability of Hep-2 cells in each group
圖3 各組Hep-2細(xì)胞侵襲能力Fig.3 Invasion ability of Hep-2 cells in each group
將ECRG4過表達(dá)質(zhì)粒及空載體對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子 Snail、EMT上皮標(biāo)志物E-cadherin、EMT間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vinmentin蛋白水平。結(jié)果顯示,與Control組及Vector組相比,ECRG4組轉(zhuǎn)錄因子Snail蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),見圖5A;上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白顯著上調(diào)(P<0.01),見圖5B;EMT間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vinmentin蛋白表達(dá)顯著下調(diào),見圖6A和圖6B。
惡性喉鱗癌是一類具有高度侵襲性、預(yù)后狀況差的頭頸部腫瘤,ECRG4在喉癌組織及細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)。在本課題組前期研究中,ECRG4在喉癌組織及癌旁組織樣本中均表達(dá),但喉癌組織中ECRG4表達(dá)水平較癌旁組織顯著降低;同時(shí)檢測(cè)喉癌上皮細(xì)胞系Hep-2與LSC-1中ECRG4的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Hep-2細(xì)胞中ECRG4的表達(dá)水平顯著低于LSC-1細(xì)胞[10],故本實(shí)驗(yàn)選用ECRG4本底水平較低的Hep-2細(xì)胞系作為轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究,保障了實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
圖4 ECRG4對(duì)各組Hep-2細(xì)胞胞核與胞漿中NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of ECRG4 on the expression of NF-κ B p65 protein in nucleus and cytoplasm
圖5 ECRG4對(duì)各組Hep-2細(xì)胞Snail與E-cadherin蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of ECRG4 on the expression of Snail and E-cadherin protein in Hep-2 cells
為了確定ECRG4對(duì)喉鱗癌Hep-2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用,將ECRG4過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞,細(xì)胞劃痕和Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力,結(jié)果表明ECRG4可明顯抑制Hep-2細(xì)胞的遷移和侵襲,進(jìn)一步驗(yàn)證ECRG4是潛在的腫瘤候選抑制基因。
圖6 ECRG4對(duì)各組Hep-2細(xì)胞N-cadherin與Vinmentin蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of ECRG4 on the expression of N-cadherin and Vinmentin protein in Hep-2 cells
上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是上皮細(xì)胞從有極性不能移動(dòng)的上皮細(xì)胞通過極性改變和細(xì)胞黏附力喪失等一系列變化轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細(xì)胞,增加細(xì)胞遷移和侵襲能力的過程。EMT在Wnt、Notch等相關(guān)信號(hào)通路的作用下激活下游相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail、Twist或者ZEB,抑制上皮標(biāo)志基因E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)間質(zhì)標(biāo)記基因Vinmentin與N-cadherin 的表達(dá)[11-12]。有研究表明激活 NF-κB 信號(hào)通路可上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá),抑制EMT上皮標(biāo)志基因E-cadherin的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)肝膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲[13];在肺癌細(xì)胞A549中,大黃素通過抑制NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而抑制ATP誘發(fā)的細(xì)胞的 EMT、遷移和侵襲[14];有報(bào)道指出,抑制EMT可抑制喉鱗癌細(xì)胞的遷移和侵襲[15]。為了驗(yàn)證ECRG4是否通過 NF-κB/Snail信號(hào)通路影響EMT的發(fā)生,本研究通過Western blot方法檢測(cè)了NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白NF-κB p65在胞漿和胞核中的表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄因子Snail、EMT上皮標(biāo)志基因E-cadherin、EMT間質(zhì)標(biāo)志基因Vinmentin與N-cadherin的表達(dá)。結(jié)果顯示,過表達(dá)ECRG4可明顯下調(diào)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá),上調(diào)胞漿中NF-κB p65的表達(dá),說明ECRG4可顯著抑制 NF-κB p65轉(zhuǎn)位入核而抑制NF-κB信號(hào)通路;過表達(dá)ECRG4可明顯下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Snail,并可下調(diào)EMT間質(zhì)標(biāo)志基因Vinmentin與N-cadherin的蛋白表達(dá)、上調(diào)EMT上皮標(biāo)志基因E-cadherin的蛋白表達(dá),顯著抑制EMT發(fā)生。
綜合以上結(jié)果表明,ECRG4可能通過抑制NF-κB/Snail信號(hào)通路活性阻滯EMT的發(fā)生進(jìn)而抑制 Hep-2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。本研究明確了ECRG4對(duì)喉鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)分子作用機(jī)制,為ECRG4在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相關(guān)分子機(jī)制提供了新的有力證據(jù),揭示ECRG4可能成為喉鱗癌基因治療的潛在新靶點(diǎn)。
貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2019年2期