郭麗新，鐘 文，姜 玲

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040)

蛹蟲草［Cordyceps militaris(L.)Link］與冬蟲夏草同屬異種，《全國中草藥匯編》記載蛹蟲草子實體及蟲體可作冬蟲夏草入藥。蛹蟲草多糖(Cordyceps militarispolysaccharides，CMPS)是蛹蟲草最重要的活性成分之一，能有效抑制自由基的氧化反應(yīng)，具有抗氧化及抗衰老作用，有研究顯示，蛹蟲草可在一定程度上減輕酒精、環(huán)磷酰胺所致的肝損傷［1－4］。衰老模型的建立、衰老的機制以及對抗衰老藥物亦是當前熱點研究課題之一，目前，有對衰老模型小鼠進行蛹蟲草粉溶液灌胃、蛹蟲草菌株的發(fā)酵菌絲體粉混懸液等的研究，也有蛹蟲草胞外粗多糖液灌胃給藥對衰老小鼠巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)存在的過氧化狀態(tài)影響的研究等［5－7］，但缺乏CMPS對衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化，延緩衰老等作用的研究。細胞凋亡是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而導(dǎo)致的細胞死亡過程，其生物學(xué)作用主要在于清除無用的細胞、發(fā)育不正常的細胞、已完成任務(wù)的細胞及有害的細胞，在器官、組織的形成與成熟，以及心血管病變、神經(jīng)性病變，腫瘤的形成等方面發(fā)揮作用;瘤組織B-淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)可以通過改變線粒體的膜電位等而抑制細胞凋亡，而B-淋巴細胞瘤-2相關(guān)X(Bax)則是一種促凋亡基因，可與Bcl-2結(jié)合成二聚體，影響細胞的凋亡［8－10］。本研究通過探討CMPS對D-半乳糖所致衰老模型小鼠肝組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平的影響，及對小鼠H22瘤組織Bcl-2、BaxmRNA表達的影響，為CMPS抗氧化、抗衰老及抗腫瘤的應(yīng)用等提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品及儀器

實驗動物為ICR小鼠，清潔級，體質(zhì)量(20±2)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。藥品為CMPS注射液(50 g/L，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)生化教研室制備)，D-gal(上海試劑二廠，用生理鹽水配制為30 g/L溶液)，SOD、CAT、MDA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)，H22小鼠肝癌細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫，Bcl-2抗體、Bax抗體(Cell Signaling)。設(shè)備為酶標儀imark(BIO-Rad，美國)，PCR擴增儀(Biorad)。

1.2 方法

1.2.1 CMPS對衰老小鼠抗氧化水平的影響 將ICR小鼠隨機分為對照組、模型組、CMPS高劑量組、CMPS中劑量及CMPS低劑量組，每組15只。模型組及3個劑量CMPS組小鼠每天給予0.3 g/kg D-半乳糖溶液頸部皮下注射構(gòu)建衰老模型;同時，模型組小鼠給予0.033 g/kg生理鹽水肌肉注射，CMPS高、中及低劑量組小鼠分別給予100、50及25 mg/kg CMPS大腿外側(cè)肌肉注射(1次/d)，對照組按等量生理鹽水頸部及大腿外側(cè)肌肉注射。動物正常飼養(yǎng)，每日記錄小鼠行動、進食、飲水、生長、發(fā)育、毛色等情況。連續(xù)注射6周，采集小鼠血液，麻醉狀態(tài)下脊椎斷臼法處死實驗小鼠，腹部消毒，剪開皮膚和腹膜，剝離出肝臟，生理鹽水清洗，肝臟稱重，制備成肝勻漿液。按試劑盒說明測定肝勻漿液的SOD、CAT、MDA含量。

1.2.2 CMPS對小鼠H22瘤組織Bcl-2、BaxmRNA表達的影響 30只H22腋下移植瘤小鼠，隨機分為模型組、CMPS中劑量組及CMPS低劑量組，每組10只。小鼠移植瘤模型建立后第2天，模型組小鼠腹腔注射0.2 mL生理鹽水;CMPS中、低劑量組小鼠分別注射50、25 mg/kg的CMPS(1次/d)，連續(xù)10 d。第10天時，取瘤組織，提取RNA，參考文獻［8－10］，采用 RT-PCR 法檢測Bcl-2、BaxmRNA表達水平，以β-actin作為內(nèi)參照，計算Bcl-2、BaxmRNA的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMPS對衰老小鼠抗氧化水平的影響

2.1.1 小鼠一般狀態(tài) 觀察可見，對照組小鼠行動敏捷，進食飲水無異常，生長發(fā)育狀況良好，毛順滑有光澤;D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠活動減少，精神萎靡，倦怠嗜睡，行動遲緩，形體瘦弱，體力較弱，皮毛松散，毛色枯槁缺乏光澤，皮膚彈性差，進食明顯減少等衰老體征;CMPS組小鼠與模型組比較，活動量相對增加，活力更強，生長發(fā)育狀況與精神狀況較好，皮毛滑順有光澤。

2.1.2 小鼠肝臟SOD、CAT及MDA活性 注射6周后，與對照組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT活性下降，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，3個CMPS劑量組小鼠肝組織SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05);隨著CMPS劑量的增加，SOD、CAT活性呈升高趨勢，MDA含量呈降低趨勢，但兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。表明CMPS可提高小鼠肝組織SOD、CAT活性、降低小鼠肝組織MDA含量，減弱自由基致衰老的損傷效應(yīng)。見表1。

表1 CMPS對小鼠肝臟SOD、CAT、MDA活性比較Tab.1 Comparison of SOD，CAT and MDA activity of CMPSon livers of rats

2.2 CMPS對H22瘤組織Bcl-2、Bax mRNA表達水平的影響

結(jié)果顯示，與模型組比較，CMPS兩個劑量組H22瘤組織Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低，BaxmRNA的表達水平顯著升高(P＜0.05);與CMPS低劑量組比較，CMPS中劑量組變化更明顯(P＜0.05)。見圖 1、表 2。

圖1 H22瘤組織Bcl2、Bax及β-actin mRNA RT-PCR電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of Bcl2，Bax and β-actin RT-PCR in H22 tumor tissues

表2 H22荷瘤小鼠Bcl-2及Bax mRNA相對表達量Tab.2 Relative expression of Bcl-2 Bax mRNA in H22 tumor-bearing rats

3 討論

衰老是機體各細胞、組織、器官功能進行性下降的過程。關(guān)于衰老發(fā)生機制，在諸多學(xué)說中，氧自由基學(xué)說是目前比較公認的機制之一［11］。D-半乳糖亞急性衰老模型是常用的動物衰老模型建立方法，也是研究抗衰老藥物的經(jīng)典模型，此方法簡便而較易實現(xiàn)、價格相對低廉、結(jié)果穩(wěn)定性強，在抗衰老藥物研究等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［11－17］。機體代謝會產(chǎn)生自由基，但同時又存在有效的清除自由基的代謝過程，二者維持相應(yīng)的平衡。SOD幾乎存在于所有生物細胞中，是重要的抗氧化酶，能夠清除氧自由基，而其活性大小又可反映機體清除自由基能力，CAT存在于細胞過氧化物體內(nèi)并保護機體免受有害物質(zhì)損傷［18－20］，其抗衰老機制是 SOD催化超氧化物通過歧化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為O2和H2O2，生成的H2O2可進一步由CAT催化分解為H2O和O2。H2O2正常情況下可參與甲狀腺中活性碘的生成，在中性粒細胞中殺死被吞噬的細菌，亦可使過氧化物(ROOH)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o毒的醇類，但H2O2增多會產(chǎn)生毒性反應(yīng)，使酶失活，膜功能受損，生成脂褐素顆粒，與組織老化有關(guān)。當機體清除自由基的能力由于年齡的增長等而下降時，可表現(xiàn)為SOD等酶活力下降，清除自由基的能力減弱，過量的自由基引起DNA損傷，細胞膜上的不飽和脂肪酸產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等，引起細胞衰老［21－22］。MDA是發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)最重要的代謝產(chǎn)物之一，測定其含量高低可間接推斷出自由基對機體損傷的程度［23］。

本研究通過建立D-半乳糖所致衰老模型小鼠，探討CMPS對其延緩衰老的作用及機制。實驗結(jié)果顯示，對照組小鼠行動敏捷，進食飲水無異常，生長發(fā)育狀況良好，毛順滑有光澤;而D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型小鼠活動減少，精神萎靡，倦怠嗜睡，行動遲緩，形體瘦弱，體力較弱，皮毛松散，毛色枯槁缺乏光澤，皮膚彈性差，進食明顯減少等衰老體征;給予CMPS后，與模型組比較，CMPS組小鼠活動量相對增加，活力更強，生長發(fā)育狀況與精神狀況較好，皮毛滑順有光澤。注射6周后，與對照組比較，模型組小鼠肝組織SOD、CAT活性顯著下降，MDA含量顯著增加 (P＜0.05);與模型組比較，3個CMPS劑量組小鼠肝組織SOD、CAT活性顯著升高，MDA含量降低，具有顯著性差異(P＜0.05)。表明CMPS可提高小鼠肝組織SOD、CAT活性、降低小鼠肝組織MDA含量，減弱自由基致衰老的損傷效應(yīng)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素相互作用以及多階段的復(fù)雜過程。其中細胞凋亡與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。Bcl-2可以通過改變線粒體的膜電位等而抑制細胞凋亡［8－9］。Bax則是促凋亡基因，可與Bcl-2結(jié)合成二聚體，影響細胞的凋亡［10］。本課題組在前期通過電鏡技術(shù)觀察小鼠H22瘤組織的超微結(jié)構(gòu)改變，觀察到CMPS作用后小鼠H22瘤組織細胞出現(xiàn)早期凋亡改變，腫瘤組織內(nèi)有凋亡細胞存在，顯示CMPS具有誘導(dǎo)小鼠H22肝癌細胞凋亡作用［24］，本研究結(jié)果顯示，CMPS作用后，H22瘤組織Bcl-2 mRNA相對表達量下降，BaxmRNA相對表達量增加(P＜0.05)，與CMPS低劑量組比較，CMPS中劑量組變化更明顯(P＜0.05)。提示CMPS可能通過氧化應(yīng)激及調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的mRNA表達水平參與H22荷瘤小鼠腫瘤細胞凋亡過程，對腫瘤的防治具有進一步研究的價值。

綜上，CMPS能清除衰老小鼠肝臟的氧自由基，增強抗氧化能力，保護肝細胞;同時CMPS還可抑制脂質(zhì)過氧化，減輕自由基對細胞、組織等的嚴重損害，減弱其致衰老等的損傷效應(yīng)。CMPS可能通過調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的mRNA表達水平參與腫瘤細胞凋亡過程，對腫瘤的防治具有進一步研究的價值。