金筱茜，吳通前，馬 嵐，袁 銳，楊 丹，周 玲，高 健，王 珺，周海燕，余 芳，＊＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)臨床微生物及免疫學(xué)教研室，貴州貴陽(yáng) 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院臨床檢驗(yàn)中心，貴州貴陽(yáng) 550004)

順鉑是治療卵巢癌、睪丸癌等多種癌癥最有效的細(xì)胞毒性藥物之一［1－2］，具有較好的療效，但可引起以腎小管壞死為主要病理改變的急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)［3］，這一副作用限制了順鉑在化療中的使用。AKI病理生理學(xué)涉及免疫細(xì)胞激活［4］，巨噬細(xì)胞作為免疫細(xì)胞，在腎損傷中發(fā)揮重要作用［5］。腎損傷時(shí)單核細(xì)胞迅速浸潤(rùn)腎臟，分化為巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致腎小管早期損傷［6－8］。免疫球蛋白 Fc受體IIB(FcγRIIB)屬于免疫球蛋白家族，可表達(dá)于巨噬細(xì)胞表面，因其特有的結(jié)構(gòu)免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs，ITIM)，可通過(guò)磷酸化過(guò)程傳遞抑制性信號(hào)［9－10］。在腎小球腎炎動(dòng)物模型中，降低單核/巨噬細(xì)胞系表達(dá)FcγRIIB可減輕腎小球白細(xì)胞浸潤(rùn)，從而減輕病情［11］。巨噬細(xì)胞可分為促炎性巨噬細(xì)胞(M1)抗炎巨噬細(xì)胞(M2)［12］，持續(xù)損傷反應(yīng)中，M1通過(guò)分泌炎癥因子，引起腎小管細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)腎損傷和纖維化;在一定的微環(huán)境中，抗炎巨噬細(xì)胞(M2)分泌可再生的營(yíng)養(yǎng)因子，減少炎癥，促進(jìn)傷口愈合和腎臟恢復(fù)［13］。目前在順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷中FcγRIIB缺失對(duì)巨噬細(xì)胞及AKI病情的影響還不明確，因此本研究通過(guò)順鉑構(gòu)建野生型及FcγRIIB基因敲除小鼠AKI模型，探究FcγRIIB在AKI中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、材料與試劑

8～10周的雄性C57BL/6背景下FcγRIIB基因敲除小鼠(FcγRIIB－/－)由哥德堡大學(xué) MIVAC醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心贈(zèng)予，10周的雄性C57BL/6野生型小鼠(Wildtype，WT)購(gòu)自北京華富康生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于特定無(wú)病原體(SPF)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，22℃恒溫、相對(duì)濕度為50%～70%、12 h光/暗周期。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)倫理指導(dǎo)批準(zhǔn)并實(shí)施(證號(hào)NO 2517098)。順鉑(美國(guó)Sigma公司)，血清肌酐試劑盒(南京建成生物有限公司)，血清尿素氮試劑盒(南京建成生物有限公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(武漢華美)，多聚甲醛(美國(guó)Sigma公司)，蘇木素－伊紅(HE)試劑盒(中國(guó)索萊寶有限公司)，CD68(Proteintech Group，Inc，武漢)，山羊抗兔二抗(中國(guó)中杉金橋 ZB－2301);引物(上海生工)，The SYBR Green real time PCR kit(Applied Biosystems)，總RNA提取試劑盒(Tian-GenDp 419)，The PrimeScript RT reagent Kit with a gDNA Eraser(TAKARA BIO INC RR047A)，PerCP-cy5.5 Anti-F4/80(eBioscience)，PE-CD86(BD Biosciences)，APC-CD206(BD Biosciences)。

1.2 方法

1.2.1 分組及動(dòng)物模型 雄性WT小鼠和FcγRIIB－/－小鼠，體質(zhì)量約 20 g，按照每組 5 只隨機(jī)分為 WT 對(duì)照組(WT-Control，WC)，WT AKI模型 組 (WT-Model，WM)，F(xiàn)cγRIIB－/－對(duì) 照 組(FcγRIIB－/－-Control，F(xiàn)C)和 FcγRIIB－/－AKI模型組(FcγRIIB－/－-Model，F(xiàn)M)4 組。WM 和 FM 組腹腔注射20 mg/kg體質(zhì)量的順鉑，WC和FC組腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 樣本采集 造模72 h后麻醉后處死小鼠，采集小鼠腋動(dòng)脈血，離心后取血清用于生化測(cè)定。分離小鼠左腎，置于10%中性福爾馬林溶液中保存，用于病理蘇木素－伊紅(HE)染色和免疫組化檢測(cè)。分離小鼠右腎，以冠狀面等分成3等分，其中1/3提取腎臟單個(gè)細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)、1/3冰上勻漿后檢測(cè)組織局部炎性因子、1/3勻漿后提取腎臟mRNA。

1.2.3 生化測(cè)定 按照生化試劑盒操作檢測(cè)血清尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)，評(píng)估小鼠AKI模型是否成功。

1.2.4 HE染色 腎組織HE染色評(píng)估順鉑誘導(dǎo)AKI模型是否成功，以腎小管上皮腫脹、刷狀緣脫落、空泡變性為基礎(chǔ)，采用半定量評(píng)分法，每張切片(400×)取相同組織結(jié)構(gòu)部位隨機(jī)10個(gè)視野，0、1、2、3、4 分分別表示損傷面積 ＜10%、10% ～ ＜25%、25～＜50%、50～ ＜75%、≥ 75%，評(píng)分后計(jì)算其平均值，評(píng)估腎小管壞死(ATN)程度［14］。

1.2.5 腎組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況檢測(cè) 免疫組織化學(xué)檢測(cè)(CD68)腎組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況，隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱進(jìn)行評(píng)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)＜25%為1分，25% ～49%為2分，≥50%為3分;無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)乘積即為其評(píng)分，＜3分為陰性，≥ 3 分為陽(yáng)性［15］。

1.2.6 腎組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)腎臟組織勻漿TNF-α及MCP-1，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.7 腎組織MCP-1、MCP-1α、MCP-1β mRNA檢測(cè) 提取腎臟mRNA，應(yīng)用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Q-PCR)檢測(cè)MCP-1(CCL2)、MCP-1α(CCL3)及MCP-1β(CCL4)相對(duì)表達(dá)量。CCL2引物序列為 F-GCCTGCTGTTCACAGTTGC，R-CAGGTGAGTGGGGCGTTA，CCL3引物序列為 F-ATGAAGGTCTCCACCACTGC，R-CCCAGGTCTCTTTGGAGTCA;CCL4引物序列為F-CAAACCTAACCCCGAGCAACAC，R-GGTCTCATAGTAATCCATCCAAAGC。

1.2.8 腎組織巨噬細(xì)胞亞型檢測(cè) 提取腎臟單個(gè)細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀(Navios，Backman)檢測(cè) F4/80+CD86+(M1)、F4/80+206+(M2)巨噬細(xì)胞?？梗∈?PerCP-cy5.5 Anti-F4/80、PE-CD86、APCCD206單克隆抗體4℃避光孵育30 min，與同種屬來(lái)源陰性抗體作為陰性對(duì)照，上機(jī)檢測(cè)，使用Flowjo軟件(Tree Star Inc.，Ashland，OR)進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS22.0及GraphPad Prism6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清Scr及BUN

與FC組和WC組相比，F(xiàn)M組和WM組Scr及BUN均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);FM組Scr和BUN較WM組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示順鉑已誘導(dǎo)小鼠AKI，且FcγRIIB缺失可加重AKI。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清Scr及BUN(±s)Tab.1 The effect of FcγRIIB loss on serum Scr and BUN

表1 各組小鼠血清Scr及BUN(±s)Tab.1 The effect of FcγRIIB loss on serum Scr and BUN

(1)與WC組比較，P＜0.05;(2)與FC組比較，P＜0.05;(3)與WM組比較，P＜0.05

組別 血清Scr(μmol/L) BUN(mmol/L)WC組57.83±5.806 7.261±0.498 2 WM組 166.9±16.32(1) 14.35±1.265(1)FC組 67.09±2.875 7.389±0.351 2 FM組 253.0±29.02(2)(3) 19.60±1.235(2)(3)

2.2 腎組織學(xué)

FM組和WM組腎小管上皮腫脹、刷狀緣脫落、空泡變性，其腎小管壞死(ATN)評(píng)分明顯高于FC組和WC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且FM組ATN評(píng)分高于WM組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。提示順鉑已誘導(dǎo)小鼠AKI，且FcγRIIB缺失可加重AKI。見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠腎臟組織(HE，×400)及ATN評(píng)分Fig.1 The effect of FcγRIIB loss on kidney tuber damage

2.3 腎臟組織TNF-α、MCP-1表達(dá)

FM組、WM組腎臟組織TNF-α、MCP-1表達(dá)水平顯著高于FC組和WC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);且FM組腎臟組織TNF-α、MCP-1表達(dá)水平較WM組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

圖2 腎臟組織勻漿中TNF-α，MCP-1表達(dá)水平Fig.2 The effect of FcγRIIB loss on levels of TNF-α，MCP-1 in kidney homogenates

2.4 腎臟組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況及類型

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，F(xiàn)M組、WM組腎組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多(圖3A)，并且FM組浸潤(rùn)更多(圖3B)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。腎臟單個(gè)細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，M1類細(xì)胞在FM組及WM組有增多趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3C)，M2類巨噬細(xì)胞表達(dá)未見(jiàn)明顯差異(圖3D)。

2.5 腎組織CCL2、CCL3、CCL4 mRNA表達(dá)

與WC組和FC組相比，WM組和FM組CCL2、CCL4 mRNA表達(dá)增加(P＜0.05)，CCL3 mRNA表達(dá)有增高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。FM組腎組織CCL2、CCL4 mRNA表達(dá)水平增加較WM組更為明顯(P＜0.05)，CCL3 mRNA表達(dá)較WM組有增高的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)圖4。

3 討論

順鉑聯(lián)合其他藥物在臨床治療中有一定的副作用，如腎毒性［1，16］。臨床上通過(guò)水合作用減少腎毒性，但是仍有超過(guò)1/4患者出現(xiàn)腎功能障礙，繼而進(jìn)展為急性腎損傷，甚至腎功能衰竭［17］。因此，探討順鉑引起腎損傷機(jī)制，可為減輕化療患者不良發(fā)應(yīng)提供相應(yīng)策略。本實(shí)驗(yàn)中，順鉑誘導(dǎo)后，腎功能及腎臟病理提示順鉑導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠腎損傷，并且FcγRIIB缺失時(shí)癥狀更嚴(yán)重。同時(shí)觀察到腎組織相關(guān)巨噬細(xì)胞趨化因子和炎性因子升高，以及巨噬細(xì)胞活化等變化，提示FcγRIIB可通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)活化而導(dǎo)致急性腎損傷病情的進(jìn)展。FcγRIIB通過(guò)其特有的ITIM結(jié)構(gòu)傳遞抑制性信號(hào)，抑制PIP3活性，可引起細(xì)胞膜離子流變化，從而改變效應(yīng)細(xì)胞功能狀態(tài)，如抑制細(xì)胞活化作用，減少抗體及炎性因子生成等［18－19］。

圖3 各組小鼠腎組織巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及亞型Fig.3 The effect of FcγRIIB loss on macrophage infiltration and subtypes in renal tissues

圖4 各組小鼠腎組織CCL2、CCL3、CCL4 mRNA表達(dá)Fig.4 The effect of FcγRIIB loss on mRNA levels of CCL2，CCL3 and CCL4 in kidney tissues

巨噬細(xì)胞是免疫應(yīng)答中的重要細(xì)胞，在固有性免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用，參與多種病理生理過(guò)程，如急性腎損傷［20］。CCL2是腎損傷后募集巨噬細(xì)胞遷往損傷組織的重要趨化因子［6］。組織發(fā)生損傷時(shí)，CCL2通過(guò)介導(dǎo)骨髓釋放單核細(xì)胞，在細(xì)胞生成的多糖－蛋白質(zhì)復(fù)合物濃度梯度下，引導(dǎo)單核細(xì)胞到達(dá)損傷組織［21］。在膜性腎病、IgA腎病、腎小球硬化癥中可見(jiàn) CCL2含量增高［21］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AKI小鼠腎組織勻漿CCL2含量增加，而且FcγRIIB缺失時(shí)增加更為明顯。研究表明，給予順鉑的小鼠模型中可見(jiàn)腎臟巨噬細(xì)胞增多［22］，這與本實(shí)驗(yàn)中模型鼠腎臟組織中出現(xiàn)CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)相一致，同時(shí)可見(jiàn)FcγRIIB－/－模型鼠CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)較WT模型鼠更多，這可能與FcγRIIB－/－模型鼠腎組織勻漿CCL2更高的表達(dá)量有關(guān)。

炎性因子的活化在順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷中其起重要作用［8］，單核細(xì)胞效應(yīng)趨化因子 CCL3、CCL4是由激活的單核細(xì)胞分泌產(chǎn)生，以吸引其他免疫炎性細(xì)胞進(jìn)入損傷組織［23］。本實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)模型組腎組織CCL3、CCL4相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，在FcγRIIB－/－模型鼠更為明顯。TNF-α在急性腎損傷中扮演重要角色，TNF-α不僅可導(dǎo)致腎小管上皮損傷［24］，而且可促進(jìn)其他炎性因子和趨化因子，如IL-1β、MCP-1表達(dá)，從而使更多炎細(xì)胞遷移到損傷腎組織中［8］。本研究結(jié)果可見(jiàn)模型組腎臟組織勻漿中 TNF-α 明顯高于對(duì)照組，且 FcγRIIB－/－模型鼠明顯且高于WT模型組，炎性因子以及趨化因子高表達(dá)可能是造成FcγRIIB－/－模型鼠腎損傷癥狀更嚴(yán)重的原因之一。

有研究表明，缺乏PI3K小鼠在腎損傷時(shí)可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化為M1類細(xì)胞，從而加重病情進(jìn)展［4］。本研究在腎臟巨噬細(xì)胞分選檢測(cè)結(jié)果提示，M1類細(xì)胞在AKI組略增多，且FcγRIIB缺失時(shí)增多趨勢(shì)更明顯，而M2類巨噬細(xì)胞表達(dá)無(wú)明顯差異。這表明FcγRIIB－/－在順鉑誘導(dǎo)急性腎損傷中可能通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1類型極化而加重病情。

綜上所述，巨噬細(xì)胞參與順鉑引起的的腎損傷的發(fā)展，F(xiàn)cγRIIB可能通過(guò)抑制細(xì)胞因子及趨化因子的產(chǎn)生，減少巨噬細(xì)胞向M1類巨噬細(xì)胞極化的趨勢(shì)，從而減輕順鉑引起的腎損傷進(jìn)展。但本研究主要集中于FcγRIIB對(duì)順鉑引起急性腎損傷中巨噬細(xì)胞的影響，其他炎細(xì)胞(如中性粒細(xì)胞等)可能也不同程度參與疾病過(guò)程，將下一步研究。