黃晏軍，湯長寧，楊 爽，潘衛(wèi)東，劉杰麟＊

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，貴州貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞中心，貴州貴陽 550004;3.貴州省天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽 550004)

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤發(fā)病率的29%，其中三陰性乳腺癌是不表達(dá)雌激素受體、人表皮生長因子受體-2(HER2)和孕激素受體的惡性腫瘤，該類乳腺癌治療預(yù)后差、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、死亡率較高，已成為近年來科研學(xué)者研究的焦點(diǎn)。由于三陰性乳腺癌患者缺少相應(yīng)受體的表達(dá)，因此患者無法從針對(duì)乳腺癌的靶向治療中獲益?；熓悄壳拜^常用的治療方法，許多新型的化療藥物也正在研究之中［1－2］。漢防己堿又名漢防己甲素，屬于雙芐基易喹啉類生物堿，是一種由粉防己的根部提取的中藥成分，早期的研究表明漢防己堿具有抗感染，鎮(zhèn)痛等多種臨床功效，臨床用于治療心血管疾病、矽肺和免疫性疾病等［3］。除此之外，漢防己堿衍生物的功效也在研發(fā)探索過程中，部分衍生物在抑制腫瘤細(xì)胞生長方面有良好的效果。BLM解旋酶參與了DNA復(fù)制、重組、損傷修復(fù)等一系列過程［4］。乳腺癌易感基因1(BRCA1)主要參與了DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)［5］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)漢防己堿衍生物能夠調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路，抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，如漢防己堿衍生物P-42、漢防己堿衍生物HL-42和漢防己堿衍生物HL-49均能誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)［6－7］。本文將探討漢防己堿衍生物YZ-18對(duì)MDAMB-231細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)的影響，并探討其誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，以尋找藥物治療三陰性乳腺癌的新途徑，為新型抗腫瘤藥物的研制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

漢防己堿衍生物YZ-18由貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。DMEM高糖培養(yǎng)液購自HyClone公司，細(xì)胞培養(yǎng)用的胎牛血清購自天杭生物科技公司，MTT試劑購自索萊寶科技公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC/PI雙染)購自天根生化科技公司，一抗(兔抗人β-actin單克隆抗體、BLM多克隆抗體、BRCA1多克隆抗體)以及二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體)購自博奧森生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) TNBC MDA-MB-231細(xì)胞保存在貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞研究中心，使用含有10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 MDA-MB-231細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法檢測MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況。取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板(按照每孔2.5×104個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細(xì)胞(藥物終濃度為0、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)。分別培養(yǎng)1、2和3 d后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20μL，于培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清液后，每孔加入 DMSO 150μL溶解結(jié)晶，采用酶標(biāo)儀測定各藥物處理組吸光度(OD值)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，并計(jì)算各藥物處理組細(xì)胞的增殖抑制率［細(xì)胞增殖抑制率=(對(duì)照組OD－實(shí)驗(yàn)組OD)/對(duì)照組OD)×100%］，并計(jì)算不同濃度漢防己堿衍生物YZ-18作用不同時(shí)間的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.2.3 MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力檢測 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力。取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板(按照每孔3×102個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細(xì)胞(終濃度為 0、0.25、0.5、1、2.5、5 μmol/L)。藥物作用2 d后換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。7 d后終止培養(yǎng)，棄上清液后，甲醇溶液固定細(xì)胞，行Giemsa染色，倒置顯微鏡下觀察集落生長情況，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，并計(jì)算各藥物處理組細(xì)胞集落形成數(shù)目。

1.2.4 MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡檢測 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡情況。取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板(按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細(xì)胞(終濃度為0、1、8μmol/L)。藥物作用2 d后，收集各藥物處理組細(xì)胞，先加入Annexin V-FITC染色液避光染色后，再加入PI染色液避光染色，染色后立即用流式細(xì)胞儀檢測各組的凋亡率，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 MDA-MB-231細(xì)胞中BLM、BRCA1蛋白表達(dá)水平檢測 Western blot法檢測MDA-MB-231細(xì)胞BLM、BRCA1蛋白表達(dá)水平。漢防己堿衍生物YZ-18作用后取對(duì)數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板(按照每孔2×105個(gè)細(xì)胞)，待細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細(xì)胞(終濃度為0、1、8μmol/L)。作用2 d后，收集各藥物處理組細(xì)胞，裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取總蛋白，并測定蛋白濃度。經(jīng) SDSPAGE電泳后濕法轉(zhuǎn)膜，與兔抗人 β-actin、BLM、BRCA1抗體4℃孵育過夜，與二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體)37℃孵育2 h，加入 ECL化學(xué)發(fā)光試劑后立即使用化學(xué)發(fā)光儀檢測蛋白條帶，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 漢防己堿衍生物YZ-18可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖活性

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用MDA-MB-231細(xì)胞1、2和3 d后，通過MTT法檢測細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為 0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)作用 MDA-MB-231 細(xì)胞1、2和3 d后均能抑制細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，且呈現(xiàn)藥物濃度和處理時(shí)間依賴性，見圖1。YZ-18作用MDA-MB-231細(xì)胞24、48、72h的IC50值分別為(3.89 ±0.27)、(2.97 ±0.34)、(1.59 ±0.13)μmol/L。

圖1 YZ-18對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響Fig.1 The effect of YZ-18 on the proliferation of MDA-MB-231 cells by MTT assay

2.2 漢防己堿衍生物YZ-18可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的克隆形成能力

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用細(xì)胞2 d，繼續(xù)培養(yǎng)1周后，通過平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測各藥物濃度組MDA-MB-231細(xì)胞的集落形成數(shù)量。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為0.25、0.5、1、2.5μmol/L)干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞后，各藥物作用組集落數(shù)量均明顯減少(P＜0.001)，且呈現(xiàn)出藥物濃度依賴性。見圖2。

圖2 YZ-18對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞克隆形成能力的影響(Giemsa，×400)Fig.2 The effect of YZ-18 on clone formation of MDA-MB-231 cells was detected by plate clone formation assay

2.3 漢防己堿衍生物YZ-18可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用MDA-MB-231細(xì)胞2 d后，采用流式細(xì)胞儀觀察各藥物濃度組細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為1和8μmol/L)干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞后，各藥物濃度處理組MDA-MB-231細(xì)胞的凋亡率均明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。且呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。見圖3。

圖3 YZ-18對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effect of YZ-18 on apoptosis of MDA-MB-231 cells

2.4 漢防己堿衍生物YZ-18對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中BLM、BRCA1蛋白表達(dá)水平的影響

分別用不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18作用MDA-MB-231細(xì)胞2 d后，采用Western blot法檢測各藥物濃度組 MDA-MB-231細(xì)胞中 BLM、BRCA1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度的漢防己堿衍生物YZ-18(藥物終濃度為1和8μmol/L)干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞后，細(xì)胞中BLM蛋白表達(dá)上調(diào)，BRCA1蛋白表達(dá)下調(diào)，且呈現(xiàn)藥物濃度依賴性。見圖4。

圖4 YZ-18對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞中BLM、BRCA1蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 The effect of YZ-18 on protein expression of BLM，BRCA1 in MDA-MB-231 cells

3 討論

漢防己堿作為傳統(tǒng)的中藥成分，目前臨床上主要用于抗感染、鎮(zhèn)痛、控制血壓等［3］，大量研究表明，漢防己堿可以作為腫瘤化學(xué)療法的一個(gè)潛在藥物，漢防己堿能夠抑制胃癌、結(jié)直腸癌、等多種惡性腫瘤細(xì)胞的生長，也陸續(xù)報(bào)道了在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面的部分作用機(jī)制。有探索發(fā)現(xiàn)，漢防己堿能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞異種移植后的生長［8］，通過激活胞內(nèi)線粒體中Caspase相關(guān)蛋白途徑來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡［9］，發(fā)現(xiàn)漢防己堿可以作為細(xì)胞膜Ca2+通道阻斷劑和Ca2+通道拮抗劑來抑制腫瘤生長［10］。漢防己堿可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的凋亡，與此同時(shí)，在TGF-β引導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞激活的過程中，它還可以阻斷其激活途徑［11］。Tian 等［12］在研究漢防己堿干預(yù)人骨肉瘤細(xì)胞的增殖時(shí)發(fā)現(xiàn)漢防己堿主要是通過上調(diào)PTEN通路起作用。在研究漢防己堿誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡時(shí)，He等［13］發(fā)現(xiàn)其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)，Chen等［14］發(fā)現(xiàn)可能與其調(diào)節(jié) PI3K/Akt信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。Zhang等［15］發(fā)現(xiàn)它在肝細(xì)胞癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移方面起著關(guān)鍵的作用，可以干預(yù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，用1、2、4、8、16μmol/L漢防己堿衍生物YZ-18干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞1、2和3 d后均能抑制細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。呈現(xiàn)藥物濃度和處理時(shí)間依賴性。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，漢防己堿衍生物YZ-18干預(yù)MDA-MB-231細(xì)胞2 d后，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱，且抑制效應(yīng)呈現(xiàn)處理濃度依賴性。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，漢防己堿衍生物YZ-18干預(yù)細(xì)胞后，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，且凋亡效應(yīng)依賴藥物濃度。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，YZ-18能夠有效抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)其凋亡。為了深入探討YZ-18干預(yù)抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)檢測了BLM蛋白和BRCA1蛋白的表達(dá)。

DNA損傷普遍存在于真核細(xì)胞中，紫外線照射、電離輻射以及化學(xué)制劑等各種因素均能導(dǎo)致DNA損傷，其中最嚴(yán)重的是DNA雙鏈斷裂(DSB)。發(fā)生DSB后可引起細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯，此時(shí)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)應(yīng)答開始發(fā)揮作用［16］。人類RecQ DNA解旋酶家族中有 RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5等5種RecQ解旋酶，主要是維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定［4］。BLM蛋白作為細(xì)胞內(nèi)重要的DNA損傷修復(fù)酶，當(dāng)基因因外力因素導(dǎo)致DNA雙鏈發(fā)生損傷時(shí)，可以通過代償性表達(dá)BLM解旋酶來發(fā)揮DNA損傷修復(fù)功能［17］。BRCA1作為DNA損傷修復(fù)信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)蛋白，能夠維持基因組的穩(wěn)定，主要是通過激活DNA損傷修復(fù)的調(diào)控點(diǎn)起作用［18］。比如在同源重組修復(fù)過程中，主要是通過以BRCA1為中心的復(fù)合物感知DNA損傷，繼而引導(dǎo)同源重組修復(fù)的關(guān)鍵酶(Rad51)啟動(dòng)同源重組途徑，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)［19］。除此之外，BLM 解旋酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶IIIα、RecQ介導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定蛋白1(RMI1)和RecQ介導(dǎo)的基因組不穩(wěn)定蛋白2(RMI2)可以形成BTR復(fù)合物，該復(fù)合物與Rad51、BRCA1相互作用進(jìn)而在同源重組修復(fù)過程中分解dHJ，修復(fù)DNA雙鏈斷裂［20］?？傊?，BLM蛋白和BRCA1蛋白均與DNA損傷修復(fù)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，YZ-18干預(yù)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞后，細(xì)胞中BLM蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，BRCA1蛋白明顯低于對(duì)照組，表達(dá)水平明顯依賴藥物濃度。據(jù)以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推測，可能是由于漢防己堿衍生物YZ-18處理細(xì)胞后導(dǎo)致了胞內(nèi)DNA的損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)DNA損傷修復(fù)應(yīng)答，BLM蛋白通過表達(dá)上調(diào)，BRCA1蛋白通過表達(dá)下調(diào)，參與DNA損傷修復(fù)應(yīng)答，同時(shí)引導(dǎo)相關(guān)凋亡信號(hào)的激活，引起細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。

綜上，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)漢防己堿衍生物YZ-18干預(yù)后，乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖和集落形成能力均受到抑制，凋亡率增加。推測可能的機(jī)制是，漢防己堿衍生物YZ-18可以通過調(diào)節(jié)DNA損傷修復(fù)通路途徑進(jìn)而調(diào)控胞內(nèi)凋亡信號(hào)通路的傳導(dǎo)。因此本實(shí)驗(yàn)為漢防己堿衍生物YZ-18作為抗腫瘤新藥的研發(fā)應(yīng)用提供了可靠的研究證據(jù)。