何爽，翟雅芯，王德萍，侯真珍，張愛勤?

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830047;2.克拉瑪依市高級(jí)中學(xué)，新疆 克拉瑪依834000; 3.新疆九洲熏蒸消毒有限責(zé)任公司，新疆 烏魯木齊830011)

0 引言

繁殖是生物繁衍后代延續(xù)種族最基本的行為和過程，對(duì)于兼性繁殖的克隆植物來說，有性繁殖常被認(rèn)為是適應(yīng)不穩(wěn)定環(huán)境和物種地理遷移的重要手段[1].然而，受生態(tài)和遺傳條件影響，有性繁殖在不同物種間，以及在同一物種的不同分布區(qū)間均存在巨大差異.克隆繁殖有助于植物在異質(zhì)性生境中擴(kuò)張空間、捕獲資源，但是，較大的克隆投資無形中增加了對(duì)有性繁殖的對(duì)抗，一些物種由于克隆生長(zhǎng)使得有性繁殖顯得極為脆弱，甚至瀕危[2,3].植物有性與無性繁殖間的沖突之一是兩種繁殖方式間的分配權(quán)衡，以及克隆繁殖對(duì)花粉擴(kuò)散和交配系統(tǒng)所產(chǎn)生的影響[4,5].克隆生長(zhǎng)一定程度增加了花展示，但同時(shí)也增加了同株異花授粉的比例和克隆株內(nèi)花粉的傳遞.很多自交不親和的克隆植物因?yàn)樽曰▊鞣郾壤^高而導(dǎo)致有性繁殖受阻[6?8].在低溫的高山環(huán)境，克隆植物的有性繁殖還受傳粉者數(shù)量、種類、訪花行為的限制.

北極花（Linnaea borealisL. ）是位于北半球高寒地帶的單種屬忍冬科北極花族植物，主要分布在北美和歐亞等地，具克隆生長(zhǎng)習(xí)性，由于分布區(qū)的不斷縮小，在蘇格蘭等地已被定為瀕危物種[9].在我國(guó)目前仍做為珍稀種被記載[10].已報(bào)道的對(duì)蘇格蘭分布區(qū)北極花的研究顯示，自然居群的結(jié)實(shí)率在0～25%之間，居群的片斷化以及大克隆斑塊中親和花粉的缺乏是導(dǎo)致有性繁殖受阻的主要原因[2,11].而在斯堪的納維亞半島，居群自然結(jié)實(shí)率在24～60%之間，表現(xiàn)出不同分布區(qū)結(jié)實(shí)狀況的較大差異.位于新疆北部的北極花居群為歐亞分布區(qū)的邊緣居群.空間的分離和環(huán)境因子的差異，使得新疆境內(nèi)的北極花居群有著怎樣的有性繁殖狀態(tài)和傳粉模式是一個(gè)值得探討的問題.前期觀測(cè)顯示作為游擊型克隆植物的北極花訪花者并不少，結(jié)實(shí)初期也有著很高的結(jié)實(shí)率，而到后期卻大量脫落，其影響因素并不清楚.為此，本文從北極花的開花習(xí)性、花部特征、傳粉昆蟲的訪花行為及結(jié)實(shí)格局等方面對(duì)其進(jìn)行研究，以探討北極花的有性繁殖狀態(tài)及其在花粉傳遞方面的影響因素.同時(shí)，為植物繁育系統(tǒng)多樣性的研究及世界范圍內(nèi)珍稀、瀕危物種的保護(hù)與交流提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)及試驗(yàn)材料

研究地點(diǎn)位于喀納斯國(guó)家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)(86°55′E ～87°03′E 48°36′N ～48°42′N)，海拔1 500 ～2 000m的針葉林下.年均氣溫4?C左右，7月份平均氣溫15～20?C，屬溫帶高寒山區(qū)氣候.

研究材料北極花為匍匐狀的常綠小灌木, 具游擊型克隆構(gòu)型，主莖柔軟細(xì)長(zhǎng)，分株須根在3～5cm 的土層內(nèi).每花序具2 花，雙懸垂，粉紅色或粉白色，花果期在6～8 月.與伴生種越橘(Vaccinium vitis-idaeaL. )、鐮狀卷耳（Cerastium bungeanumVyed.）、獨(dú)麗花（Moneses uniflora(Linn.) A. Gray）等的花期有重疊.研究時(shí)間為2014～2016年的花期和結(jié)實(shí)期.

1.2 研究方法

1.2.1 開花物候及開花習(xí)性的觀測(cè)

花期，隨機(jī)標(biāo)記不同植株上即將開放的花序和單花各15個(gè)（朵），進(jìn)行花序及單花開放動(dòng)態(tài)的連續(xù)觀察，記錄花序開放的持續(xù)時(shí)間、單花壽命、開放特點(diǎn)、雌雄蕊的生長(zhǎng)狀態(tài)及花粉散布情況，并對(duì)物候期進(jìn)行觀察.

1.2.2 花部特征及花粉、柱頭形態(tài)的掃描觀察

花部特征參數(shù)的測(cè)定: 盛花期，隨機(jī)采集不同基株上正開放的單花30朵，分別進(jìn)行花冠開口直徑、花冠長(zhǎng)、雌雄蕊長(zhǎng)度的測(cè)定.測(cè)量工具為游標(biāo)卡尺（精度0.02mm）.

花粉量、胚珠數(shù)及花粉敗育率的測(cè)定：參照Cruden(1997)的方法[12]，盛花期，在標(biāo)記的20個(gè)分株上隨機(jī)選取30朵即將開放的花苞固定，帶回室內(nèi)統(tǒng)計(jì)各單花花粉的數(shù)量和胚珠數(shù). 同時(shí)，另取20個(gè)即將開放的單花，進(jìn)行花粉敗育率的檢測(cè).

不同散粉時(shí)間柱頭花粉數(shù)的測(cè)定及自動(dòng)自花授粉的檢測(cè)：盛花期，在50個(gè)分株上隨機(jī)標(biāo)記剛開放的單花150個(gè)，從開放當(dāng)天開始，每天取標(biāo)記單花30個(gè)，連續(xù)5d進(jìn)行單花柱頭花粉數(shù)統(tǒng)計(jì).同時(shí)，隨機(jī)選取20個(gè)剛開放沒散粉的單花進(jìn)行套袋，4d后，進(jìn)行套袋內(nèi)柱頭花粉數(shù)的統(tǒng)計(jì).

花粉及柱頭形態(tài)的掃描觀測(cè)：盛花期，在不同分株上隨機(jī)選取不同時(shí)期的單花各20個(gè)，剝出花柱，立即用2%的戊二醛固定液(0.1mol/L磷酸緩沖液配置)固定，帶回室內(nèi)用于不同散粉時(shí)期柱頭形態(tài)的掃描觀察.所取材料為：1）即將開放的單花；2）開放后上邊2枚雄蕊正散粉的單花；3）開放后下面2枚雄蕊散粉的單花；4）成熟的花粉粒.花粉和柱頭樣品的制備參照黃云蘭等的方法進(jìn)行[13].

1.2.3 北極花及伴生種的傳粉媒介和花粉散布格局

盛花期，在北極花的實(shí)驗(yàn)樣地隨機(jī)選取樣方6個(gè)（2m×3m），統(tǒng)計(jì)每樣方內(nèi)正開放的北極花以及伴生種的種類和開花數(shù)目，通過人工移栽補(bǔ)充伴生種的開花種類和數(shù)目，構(gòu)成半人工居群6個(gè)，在晴朗天氣下進(jìn)行連續(xù)觀測(cè)（每次30min，累計(jì)30h），分別記錄北極花及伴生種的訪花昆蟲種類，訪花行為與訪花頻率.在昆蟲訪花距離的調(diào)查中，我們?cè)O(shè)同一花序上的兩朵單花的距離為0，每20cm為一個(gè)范圍，通過記錄訪花者每次在花間訪問時(shí)相鄰兩花間的距離，統(tǒng)計(jì)不同距離范圍內(nèi)發(fā)生的頻次，分析北極花的花粉散布格局.測(cè)量距離的工具為卷尺（精度cm）.

1.2.4 花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)狀況的熒光觀察

盛花期，在不同的分株上隨機(jī)標(biāo)記即將開放的單花約300朵，從單花開放起，每隔8～10h隨機(jī)選取單花10～15朵，用FAA固定液（70%乙醇-福爾馬林-乙酸配置）固定，帶回室內(nèi)進(jìn)行樣品處理后，通過熒光顯微鏡觀測(cè)不同時(shí)間段北極花的花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)狀況.

1.2.5 結(jié)實(shí)格局

隨機(jī)標(biāo)記1m ×1m的北極花樣方30個(gè)，分別在結(jié)實(shí)初期和后期統(tǒng)計(jì)每樣方中有性分株頂端不掛果實(shí)、掛1個(gè)果實(shí)、2個(gè)果實(shí)的比例，計(jì)算北極花不同結(jié)實(shí)階段的平均結(jié)實(shí)率，分析不同階段果實(shí)形成狀態(tài)及分布格局.

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel2007 軟件和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析. 首先用One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test 進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)，經(jīng)檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布后，用One-Way ANOVA 或t檢驗(yàn)進(jìn)行花部特征中各相關(guān)參數(shù)的比較.統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示.

2 結(jié)果

2.1 開花物候與開花習(xí)性

連續(xù)3年的物候期觀測(cè)顯示，北極花初花期在6月底或7月初，1周左右進(jìn)入盛花期，7月底或8月初進(jìn)入結(jié)實(shí)期，年份間有波動(dòng).北極花的花序生于有性分枝的頂端，同一基株上的幾個(gè)雙懸花可同步開放.但同一花序上雙懸的兩單花具典型的序次開放現(xiàn)象，往往一朵花正在散粉或散粉后另一朵花才相繼開放，兩花開放間隔1～2d.

先開放的單花，花冠口半張，柱頭探出，花冠內(nèi)壁具白色毛狀附屬物，濃密、飽滿、直立，交叉成網(wǎng)狀覆蓋在雄蕊上.隨著花冠開口的進(jìn)一步張開，毛狀附屬物從花冠口開始逐漸倒伏，約3～4h后，露出花中較高的兩枚雄蕊，并開始散粉.隨花冠內(nèi)側(cè)毛狀附屬物的繼續(xù)倒伏，在上邊兩枚雄蕊散粉即將結(jié)束時(shí)，下面兩個(gè)較矮的雄蕊也逐步暴露出來，并開始散粉.兩對(duì)雄蕊散粉完畢需2～3d，散粉后的單花持續(xù)1～2d脫落，單花期4～5d.花序開放時(shí)間5～7d.

2.2 花部特征及花粉、柱頭形態(tài)

2.2.1 花部特征參數(shù)的測(cè)定

北極花的花冠鐘狀，下垂，雌雄異位，四枚雄蕊兩兩序次呈現(xiàn)，如圖2 f.每單花有花粉量2 504±120粒，胚珠10±1枚，受精后只有1個(gè)胚珠可發(fā)育成種子.對(duì)上、下兩枚花藥的敗育率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩者無顯著差異.

對(duì)不同散粉時(shí)期的柱頭花粉數(shù)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1.隨著開花時(shí)間的延長(zhǎng)，柱頭花粉數(shù)在逐步增高，在開放后第4～5d時(shí)達(dá)最高，說明柱頭被拜訪的次數(shù)在逐步增加.其中，在單花開放的第1 ～2d，只有上兩枚雄蕊散粉時(shí)，在標(biāo)記的單花中43.9%的柱頭有花粉，到了第4～5d，下兩枚花藥處于散粉或散過粉狀態(tài)時(shí)，在標(biāo)記的單花中有84.2%的柱頭有花粉，平均柱頭花粉數(shù)為17.93±3.09粒.自然狀態(tài)下，套袋內(nèi)柱頭花粉數(shù)為0，說明無自動(dòng)自花授粉現(xiàn)象.

表1 北極花花部特征參數(shù)Tab 1 Floral traits parameters of Linnaea borealis

圖1 北極花不同開花時(shí)期柱頭花粉數(shù)Fig 1 The No. of pollen grains on stigma in different flowering days

2.2.2 花粉及不同時(shí)期柱頭形態(tài)的掃描

對(duì)北極花花粉和不同時(shí)期柱頭形態(tài)的掃描觀測(cè)顯示：待開花苞的柱頭表面形態(tài)與正散粉的柱頭無顯著差異，柱頭乳突細(xì)胞均飽滿有活力，表明在花藥散粉前柱頭即具有接受花粉的能力(圖2 a-b).北極花的花粉粒近球形，具3個(gè)萌發(fā)孔和刺狀突起的外壁紋飾(圖2 c).

2.2.3 花粉萌發(fā)及花粉管的生長(zhǎng)狀態(tài)

熒光觀測(cè)顯示：北極花的柱頭花粉均能正常萌發(fā)和進(jìn)行花粉管的生長(zhǎng)(圖2 d-e).開放后8h開始有花粉萌發(fā)，隨著開花時(shí)間的延長(zhǎng)，柱頭上萌發(fā)花粉的數(shù)目和有花粉的柱頭數(shù)目在明顯提高.其中，開放后0～24h、25～50h 和50～72h，分別有17.2%、43.3% 和70%的柱頭有花粉數(shù)，在72h后出現(xiàn)有生長(zhǎng)到子房的花粉管.這與自然狀態(tài)下所測(cè)柱頭花粉數(shù)一致.所有有花粉的花柱，均處于花粉萌發(fā)或花粉管生長(zhǎng)狀態(tài).但生長(zhǎng)到子房頂部的花粉管數(shù)量很低，約占相同散粉時(shí)段有花粉柱頭的1/3.

2.3 傳粉者訪花情況及傳粉距離

北極花的訪花昆蟲有蠅、食蚜蠅、獨(dú)居蜂，其中，蠅為主要的訪花者，約占總拜訪次數(shù)的70%.晴朗天氣，10:00以后有昆蟲出現(xiàn)，12:00～17:30訪花昆蟲數(shù)量較多，為訪花高峰期，19:00以后逐步減少.平均訪花頻率為0.102 4±0.056 7次/花/h. 訪花昆蟲活動(dòng)受光照和氣候條件影響較大，同一時(shí)間段，晴朗天氣和有陽(yáng)光照射的地方訪花昆蟲較多，而陰雨天氣和遮陰的地方無訪花昆蟲或訪花昆蟲很少.

北極花與伴生種的花期不完全一致，但有重疊，且訪花昆蟲種類一致.通過移栽伴生種，構(gòu)建半人工居群觀測(cè)訪花偏好及訪花頻率，結(jié)果表明：北極花與伴生種間有昆蟲互訪現(xiàn)象，但無明顯的訪花偏好.其中伴生種獨(dú)麗花的花期較早，在北極花的盛花期，獨(dú)麗花已到盛花末期，其訪花頻率為0.009 5±0.009 5次/花/h；鐮狀卷耳的訪花頻率為0.246 5±0.058 6次/花/h；伴生種的平均訪花頻率為：0.102 9±0.027 7次/花/h，與北極花(0.102 4±0.056 7)相比二者無顯著差異(t=1.559;P=0.121).

對(duì)昆蟲所訪相鄰兩朵花的距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì)（圖3），不同訪花距離的發(fā)生頻率并不相同，傳粉者對(duì)花粉的傳播距離主要集中在0～20cm范圍之內(nèi)，發(fā)生頻率達(dá)58.33%，其中在同一花序上訪問的發(fā)生頻率為13.33%；20～40 cm范圍內(nèi)的發(fā)生頻率為18.33%，隨著距離的增加，發(fā)生頻率在逐步降低.

圖2 北極花花序、花粉，柱頭的形態(tài)觀察及花粉的萌發(fā)與生長(zhǎng)Fig 2 The morphological obvision of inflorescence, pollen grains, stigma as well as the pollen germination and pollen tube growth of L. borealise

圖3 北極花花粉傳播距離的頻率分布Fig 3 The frequency distribution of pollen migration distance

2.4 結(jié)實(shí)格局

對(duì)分布區(qū)內(nèi)各樣方的結(jié)實(shí)率及果實(shí)分布格局進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖4.在北極花的不同結(jié)實(shí)階段，結(jié)實(shí)率及果實(shí)分布格局明顯不同.結(jié)實(shí)初期，平均結(jié)實(shí)率為82.18±1.48%，該階段為進(jìn)入結(jié)實(shí)期的第10d，雖然果實(shí)存在，但果實(shí)膨大不明顯，果實(shí)內(nèi)的胚珠也沒表現(xiàn)出明顯的變化，掛2個(gè)果的比例最高，達(dá)59.65±2.8%，掛1個(gè)果和不掛果的比例分別為31.01±3.03%，9.33±1.67%，顯著不同.到結(jié)實(shí)后期，平均結(jié)實(shí)率僅為34.85±4.18%，該階段為進(jìn)入結(jié)實(shí)期的第25d，果實(shí)膨大明顯，果實(shí)內(nèi)有正發(fā)育的種子.從果實(shí)的分布格局看，在結(jié)實(shí)后期，掛1個(gè)果(24.32±2.21%)和掛2個(gè)果(22.69±3.88%)的比例遠(yuǎn)低于不掛果的花序比例(52.99±4.72%).結(jié)實(shí)后期，掛1個(gè)果的比例(24.32±2.21%)與初期(31.01±3.03%)沒有差異，但是掛2個(gè)果的比例(22.69±3.88%)顯著低于結(jié)實(shí)初期(59.65±2.8%).

圖4 北極花的結(jié)實(shí)格局及不同階段的結(jié)實(shí)率Fig 4 The fruit-set pattern and the fruit- set rate of L.borealisein different fruiting stage

3 討論

同株異花授粉對(duì)植物的交配系統(tǒng)具有重要影響，在克隆植物中表現(xiàn)的尤為突出.為此，有花植物表現(xiàn)出了多種性狀以降低同株授粉的影響.但是由于傳粉過程中影響因素的復(fù)雜性，使得這些性狀的有效性不同[15,16].尤其在較大斑塊的克隆植物內(nèi)更是難以避免[17,18].在北極花中，花部特征、開花習(xí)性、游擊型克隆構(gòu)型及自交不親和性等性狀在降低雌雄蕊干擾、避免同株異花授粉方面具有積極作用，但是較短的傳粉距離所導(dǎo)致的高比例的同株異花授粉現(xiàn)象尤為突出，并成為影響北極花有性繁殖的重要因素.

3.1 花展示及同株異花粉的生殖干擾

雌雄異熟和雌雄異位是植物常見的兩種避免花內(nèi)自交和降低雌雄干擾的機(jī)制[14,19]. 北極花雌蕊高8.60±0.15 mm，二強(qiáng)雄蕊高度分別為5.91±0.11 mm，4.12±0.07 mm，單花半開時(shí)，雌蕊已探出，并具活力，而雄蕊仍被花冠內(nèi)毛狀附屬覆蓋，隨著毛狀附屬物逐漸倒伏，才暴露出較高的兩枚雄蕊，從雌蕊探出到上兩枚花藥開始散粉，間隔3～4h左右，表現(xiàn)出典型的雌雄異位和不完全的雌雄異熟.這為避免花內(nèi)自花粉滯留和降低雌雄蕊干擾提供了保障.

在單花水平，北極花4枚雄蕊兩兩序次呈現(xiàn)，使得單花期持續(xù)4～5 d；而在花序上，雙懸的兩單花具典型的序次開放現(xiàn)象，使得花序開放時(shí)間得到了延長(zhǎng)，達(dá)6～7d.對(duì)北極花不同時(shí)期花柱頭花粉數(shù)的檢測(cè)可以看出，從上兩枚雄蕊散粉時(shí)，43.9%的柱頭有花粉，到下兩枚花藥處于散粉或散過粉狀態(tài)時(shí)，81.4%的柱頭有花粉，隨著散粉時(shí)間的推遲，北極花柱頭花粉數(shù)和有花粉的柱頭數(shù)目均在增加. 相同的例子，在由蜂鳥傳粉的雌性先熟的藤本植物Bomarea acutifolia中，6枚雄蕊依次開裂，一個(gè)花序的散粉時(shí)間可持續(xù)9d[20].在缺乏傳粉者或低溫的高山環(huán)境，花粉的序次呈現(xiàn)對(duì)于提高雄性適合度以及對(duì)高山或極地等嚴(yán)酷環(huán)境適應(yīng)性的提高均具重要意義[21?23].

然而，自然狀態(tài)下北極花較低的結(jié)實(shí)率（34.85±4.18%）反映其花展示在促進(jìn)異交方面并沒有得到有效的發(fā)揮.北極花柱頭花粉數(shù)為17.93±3.09，且只有一枚胚珠可發(fā)育成種子，較充足的柱頭花粉數(shù)似乎不存在花粉限制.但是，熒光觀測(cè)顯示柱頭上正常萌發(fā)的花粉，約有1/3能夠長(zhǎng)到子房頂部.這說明柱頭上較高的花粉數(shù)顯然為不親和的同株花粉.北極花具自交不親和性，對(duì)其進(jìn)行人工異花授粉，可明顯提高結(jié)實(shí)率[24].這一現(xiàn)象在北極花的蘇格蘭分布區(qū)也有發(fā)現(xiàn)[2,11].北極花具典型的避免花內(nèi)自交，促進(jìn)異花授粉的花部綜合征，但并沒能避免同株異花授粉的生殖干擾.

3.1.1 花傳粉模式與有性生殖

影響植物花粉流傳播的因素主要受傳粉昆蟲和開花式樣的影響[25]. 蠅類在高山環(huán)境中分布較為普遍[26,27]，但具有活動(dòng)能力低，訪花時(shí)間短，訪花路徑?jīng)]有規(guī)律性等特征[28?30].北極花的訪花昆蟲有蠅、食蚜蠅和蜂.其中，蠅為主要訪花者，但訪花距離非常有限，主要集中在0～20cm范圍之內(nèi)，并成為北極花高比例同株異花授粉的主要原因.盡管北極花為游擊型克隆構(gòu)型，但居群呈明顯的斑塊狀分布[21]，較短的訪花距離限制了基株間異花粉的傳遞.同時(shí)，同期開花的植物–伴生種在增加傳粉者吸引的同時(shí)也增大了對(duì)訪花者的競(jìng)爭(zhēng)和對(duì)花粉傳遞的干擾.這些因素均增加了花粉流近距離的傳遞.種子和果實(shí)的發(fā)育通常受資源限制或花粉來源的影響，出現(xiàn)受精前或受精后的敗育.在北極花中，從結(jié)實(shí)格局的數(shù)據(jù)看，如果受資源限制，結(jié)實(shí)初期掛1個(gè)果的比例會(huì)較大，不掛果或掛2個(gè)果的比例會(huì)較低.但事實(shí)不是如此，結(jié)實(shí)初期掛2個(gè)果的比例最高，達(dá)59.65±2.8%，掛一個(gè)果的比例次之，不掛果的比例最低.也證明了北極花中較高的果實(shí)脫落率緣于不親和的高比例同株異花授粉.自交不親和降低了同株授粉的雌性代價(jià)，在基株間花粉傳遞充足的情況下，自交不親和的維持是有益的. 但是如果親和花粉限制，自交不親和將降低種子生產(chǎn)，其維持代價(jià)將會(huì)很高.在北極花中，克隆生長(zhǎng)習(xí)性、較為單一的傳粉者、較短的傳粉距離所導(dǎo)致的高比例的同株異花授粉等成為植物有性繁殖率低下的主要原因.