崔 曼，尹彥舒，張夢(mèng)琦，卜 寧，陳云云，高 淼*，馬蓮菊*

（1．沈陽(yáng)師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物資源收集與保藏重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

植物根際促生細(xì)菌（PGPR）是定殖在植物根部周圍，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)，增加植物產(chǎn)量，抵抗植物病害等功能的一類有益菌群［1-2］。大部分PGPR具有生物固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等特性及生防作用或其中之一的某種特性［3］。根際環(huán)境中，植物與微生物形成的有益關(guān)系可使植物健康生長(zhǎng)并且維持土壤肥力［4］。近年來(lái)植物根際促生菌的篩選成為研究熱點(diǎn)［5］。到目前為止關(guān)于PGPR的報(bào)道遍布國(guó)內(nèi)外，其中包括常見的芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、固氮菌屬（Azotobacter）、腸桿菌屬（Enterobacter）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）等［1-2，6-10］。大蒜是一種忌連作的蔬菜，作物連作是導(dǎo)致大蒜品質(zhì)和產(chǎn)量下降的主要因素。連作障礙產(chǎn)生的主要原因是由于土壤養(yǎng)分元素的不均衡、化感物質(zhì)積累、土壤微生態(tài)及微生物區(qū)系變化等方面導(dǎo)致的［11］。前人研究發(fā)現(xiàn)，大蒜連作15～20年后，可導(dǎo)致土壤中酶活性降低，產(chǎn)生明顯的連作障礙現(xiàn)象［12］。連作障礙產(chǎn)生后，大蒜根腐病的發(fā)病情況也隨之增加［13］。本研究中的根際細(xì)菌為前期實(shí)驗(yàn)室人員在山東省金鄉(xiāng)縣大蒜田中收集的連作大蒜根際土壤，在連作土壤中分離獲得的根際細(xì)菌。篩選出對(duì)大蒜根腐病和其他植物上的病害病原菌具有拮抗作用的菌株進(jìn)行功能特性、田間增產(chǎn)及對(duì)土壤有改良作用的菌株，為更好的改善土壤，解決大蒜產(chǎn)量及病害等多重問(wèn)題發(fā)掘潛在菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

根際微生物：連作大蒜根部中分離純化的細(xì)菌。

大蒜根腐病病原真菌：H5（Setophoma terrestris）為前期實(shí)驗(yàn)室人員在有根腐病的大蒜根部分離得到的大蒜病原真菌，H9（Fusarium solani）由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏中心提供。

1.2 培養(yǎng)基

對(duì)峙檢驗(yàn)：PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，蒸餾水 1 L，瓊脂 15 ～ 20 g，pH 值 7.0。

產(chǎn) HCN 能力檢驗(yàn)：King’s B 培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 1.5 g，K2HPO41.5 g，甘油 10 mL［14］，1.8% 瓊脂，蛋白胨 20 g，pH 值 7.2。

產(chǎn)蛋白酶能力檢驗(yàn)：蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基［14］。

溶解磷能力檢驗(yàn)：溶解有機(jī)磷能力：有機(jī)磷卵黃培養(yǎng)基［14］；溶解無(wú)機(jī)磷能力：無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基［14］。

IAA能力測(cè)定：DF培養(yǎng)基［14］。

ACC 能力測(cè)定：ADF 培養(yǎng)基［14］。

固氮能力檢驗(yàn)：無(wú)氮培養(yǎng)基［15］。

1.3 測(cè)定菌株對(duì)病原真菌的拮抗能力

采用兩點(diǎn)對(duì)峙法［16］。在PDA平板上，用直徑5 mm打孔器取大蒜根腐病病原真菌菌餅接于距離平板圓2 cm處的一點(diǎn)上，在同一直線距圓心等距反方向的另一點(diǎn)上滴加 2 μL待測(cè)菌液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。H9及處理置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，H5及處理置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，測(cè)定抑菌半徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌直徑和抑菌率計(jì)算公式：

抑菌直徑=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑

抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100

1.4 菌株16S rRNA基因序列測(cè)定

1.4.1 菌株16S rDNA的PCR擴(kuò)增

取單菌落，于裝有100 μL 無(wú)菌水的EP管中混勻，95℃水浴15 min后，于-20℃冰箱冷凍1 min，12 000 r/min 條件下離心 2 min，4℃冰箱保存，模板為上清液［14］。PCR 擴(kuò)增引物采用通用引物。擴(kuò)增后的樣品送往北京生工有限公司進(jìn)行測(cè)序，在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)上將獲得的序列進(jìn)行序列比對(duì)。

1.4.2 菌株gyrB基因的PCR擴(kuò)增

采用細(xì)菌DNA試劑盒方法提取菌株DNA，引物為：UP-1和UP-2r。反應(yīng)過(guò)程為：95℃ 5 min，94℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增后的樣品處理同 1.4.1。

1.5 菌株促生特性測(cè)定及方法

1.5.1 溶解磷能力測(cè)定

收集了2 μL的細(xì)菌懸浮液，然后將其接到有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中。Ca3（PO4）2作為無(wú)機(jī)磷源，新鮮蛋黃溶液作為有機(jī)磷源。每組3次重復(fù)，放入培養(yǎng)箱28℃，14 d。是否有透明圈圍繞形成，來(lái)判定其是否具有溶解磷的能力。

1.5.2 固氮能力測(cè)定

挑取單菌落在無(wú)氮平板上劃線，28℃培養(yǎng)，在第3 d時(shí)觀察平板上菌株生長(zhǎng)狀況，菌落可在無(wú)氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)表示其具有固氮能力。對(duì)有固氮能力的細(xì)菌進(jìn)行乙炔還原法測(cè)定固氮酶活性［17］。并對(duì)具有固氮酶活性的菌株進(jìn)行nifH基因的擴(kuò)增，反應(yīng)過(guò)程為：95℃ 1 min。58℃ 1 min，72℃ 1 min，共 35個(gè)循環(huán)。

固 氮 酶 活 性［nmol/（mg·h），protein］=C2H4（nmol）/［菌體蛋白量（mg，protein）× 反應(yīng)時(shí)間（h）］。

1.5.3 IAA能力測(cè)定

IAA產(chǎn)生的能力用比色法測(cè)定［18］。在DF培養(yǎng)基中接種菌株生長(zhǎng)24 h后轉(zhuǎn)移到含有0.1% L色氨酸的DF培養(yǎng)基中。置于28℃培養(yǎng)箱中，7 d后，8 000 r/min 離心 10 min。

懸浮液與Fe-H2SO4溶液（1∶2）混合，暗室放置45 min，通過(guò)測(cè)量450 nm處樣品吸光度和標(biāo)準(zhǔn)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.4 ACC脫氨酶活性菌株的篩選

參考 Glick［19］的方法，在 5 mL固氮液體培養(yǎng)基上接入菌種，28℃ 200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)1 d，吸取0.1 mL懸浮液至5 mL的DF培養(yǎng)基中，同條件繼續(xù)培養(yǎng)1 d后，吸取0.1 mL懸浮液至5 mL的ADF培養(yǎng)基中，同條件繼續(xù)培養(yǎng)1～2 d。將可在ADF培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌種再轉(zhuǎn)接一次，用不含ACC的ADF培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。分別以不接菌的ADF和不含ACC的ADF培養(yǎng)基為對(duì)照，測(cè)定600 nm處菌液的吸光度值，確定ACC脫氨酶的陽(yáng)性菌株。

1.5.5 產(chǎn)鐵載體能力檢測(cè)

采用藍(lán)色定性檢測(cè)培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行定性測(cè)定［20］。在CAS試驗(yàn)板上能產(chǎn)生橙色暈圈的菌株被鑒定為可產(chǎn)鐵載體的陽(yáng)性菌株。具有產(chǎn)鐵載體能力。

1.6 田間接種

在田間小區(qū)（每個(gè)小區(qū)6 m2）中設(shè)置2組試驗(yàn)：第一組：施用DS7菌劑；第二組：不施用DS7菌劑的對(duì)照組。每塊小區(qū)前后間隔5 m，每組試驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)平行重復(fù)。

1.7 土壤樣品采集和酶活性測(cè)定

用蛇形5點(diǎn)采樣法，在田間小區(qū)中采集5～20 cm土樣，用于土壤酶活性的測(cè)定。播種前在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)取樣，采集大蒜根際土壤樣品。

采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定土壤過(guò)氧化氫酶活性；采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定脲酶活性；土壤蔗糖酶活性用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定［21］。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選

供試根際細(xì)菌為前期在山東省金鄉(xiāng)縣大蒜田中采集的連作大蒜根際土壤中分離純化的細(xì)菌，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，經(jīng)兩點(diǎn)對(duì)峙實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菌株DS7對(duì)兩種大蒜根腐病病原真菌均有拮抗效果，DS7對(duì)H5（Setophoma terrestris）抑制率達(dá)到 51.72%，對(duì) H9（Fusarium solani）抑制率達(dá)到42.31%（圖 1）。

圖1 菌株DS7對(duì)大蒜根腐病病原真菌的拮抗能力

2.2 菌株DS7的16S rRNA基因序列分析

將菌株DS7基于16S rDNA獲得的基因序列和基于gyrB獲得的基因序列，分別與相近種屬的基因序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)后，根據(jù)鄰近法則結(jié)合MEGA 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，如圖2、圖3。結(jié)合其菌落形態(tài)確定菌株DS7為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）［22］。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建菌株DS7系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 基于gyrB基因序列構(gòu)建菌株DS7系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.3 菌株DS7的功能特性研究

菌株DS7能在蛋白酶檢測(cè)平板上出現(xiàn)明顯透明水解圈，表明其具有蛋白水解能力；在 King’s B 培養(yǎng)基上，含菌株DS7的濾紙出現(xiàn)深黃色變化，說(shuō)明其具有產(chǎn)HCN能力；菌株DS7可以使CAS 藍(lán)色檢測(cè)液產(chǎn)生橘黃色透明圈，說(shuō)明其具有產(chǎn)鐵載體能力。DS7具有產(chǎn)鐵載體的能力；具有溶解有機(jī)磷和無(wú)機(jī)磷的能力；具有水解蛋白能力；有產(chǎn)IAA能力；不具有產(chǎn)生ACC脫氨酶的能力，結(jié)果如表1所示。菌株DS7在平板上的情況，如圖4所示。

表1 菌株Bacillus sp. DS7的功能機(jī)制

圖 4 菌株 Bacillus sp. DS7 的功能特性

DS7可以在無(wú)氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其固氮酶活性為（0.41±0.09）nmol/（mg·h）；菌株和陽(yáng)性對(duì)照固氮菌株的固氮酶nifH基因擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示。從分子學(xué)角度上再一次確定菌株DS7為固氮菌，具有固氮能力。

圖5 菌株 Bacillus sp. DS7固氮酶nifH基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 接種菌株DS7對(duì)田間大蒜產(chǎn)量的影響

田間測(cè)產(chǎn)結(jié)果如表2，施用DS7菌劑后大蒜的產(chǎn)量比不施用任何產(chǎn)品的對(duì)照組的大蒜產(chǎn)量增加約15.42%。

表2 田間測(cè)產(chǎn)結(jié)果

2.5 接種菌株DS7對(duì)田間大蒜根際土壤酶活性的影響

測(cè)量接種菌株DS7后土壤中的蔗糖酶活性、過(guò)氧化氫酶活性和脲酶活性3種指標(biāo)檢測(cè)土壤酶活性。接種DS7菌液后，土壤蔗糖酶活性相對(duì)于對(duì)照組提高12.95%，可見接種DS7菌液后土壤肥力有所提高并改善。過(guò)氧化氫酶活性并沒有提高，反而降低2.75%，土壤中微生物的生命活動(dòng)速度減慢，可能因?yàn)榻臃NDS7后會(huì)抑制土壤中其他微生物的活動(dòng)。接種DS7可加速氨的生成，與對(duì)照組相比增長(zhǎng)率為6.80%，結(jié)果見表3。

表3 土壤酶活性結(jié)果

3 結(jié)論與討論

植物根際促生菌（PGPR）在植物生長(zhǎng)過(guò)程中對(duì)植物生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)是一類有意義的菌群，PGPR在植物的根莖或根表面定殖，通過(guò)吸收礦物質(zhì)的方式來(lái)幫助植物快速生長(zhǎng)［23］。目前常用的根際微生物是具有生物防治功能的促生菌［24］，例如：假單胞菌屬（pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium），這些微生物大多具有防病促生功能，可以有效用于防治植物病害。部分PGPR在對(duì)植物促生時(shí)可對(duì)土壤進(jìn)行修復(fù)［25］，所以在肥料開發(fā)的過(guò)程中充分利用PGPR的功能特性是解決田間植物生長(zhǎng)、土壤修復(fù)等問(wèn)題的一種環(huán)保的方法。在實(shí)際生產(chǎn)中已出現(xiàn)商家利用PGPR做成肥料并投入生產(chǎn)的情況［26］。芽孢桿菌屬主要應(yīng)用在田間農(nóng)蔬作物，前期對(duì)種子進(jìn)行處理，可防治各種苗期出現(xiàn)的病害［27］。王娜娜［28］從白皮大蒜中共分離出62株內(nèi)生菌對(duì)4種病原菌都具有拮抗作用，其中芽孢桿菌屬的數(shù)量占到84.2%。解淀粉芽孢桿菌對(duì)果蔬上的病原菌有很好的防治效果，例如：山茶灰斑病，獼猴桃灰霉病等［29-30］。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）具有抑制真菌和細(xì)菌的活性的作用，與菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物有關(guān)［31］。本研究篩選到的根際細(xì)菌DS7（Bacillus amyloliquefaciens）對(duì)大蒜根腐病病原菌抑制效果：對(duì)H5（Setophoma terrestris）抑制率達(dá)到51.72%，對(duì)H9（Fusarium solani）抑制率達(dá)到42.31%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株DS7對(duì)大蒜根腐病病害具有較好拮抗效果。

產(chǎn)鐵載體的PGPR能吸收土壤中的鐵元素提供給植物，還能夠抑制病原菌繁殖［32］。具備固氮能力、溶解磷能力的根際微生物，可以為自身和植物在一定程度上提供可利用的氮和磷，加快植物的生長(zhǎng)速度［33-34］。PGPR菌，例如：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium），能促進(jìn)玉米生長(zhǎng)，具有溶解無(wú)機(jī)磷、有機(jī)磷，分泌IAA能力［35］。Burkholderia sp.7016具有固氮、溶磷、產(chǎn)ACC脫氨酶，促進(jìn)番茄生長(zhǎng)及拮抗番茄土傳病害等多種功能特性［33］。本實(shí)驗(yàn)研究篩選出的DS7具有多種功能特性：水解蛋白、產(chǎn)鐵載體、固氮、溶解有機(jī)磷、無(wú)機(jī)磷和產(chǎn)IAA的能力。土壤酶活性反映了土壤中營(yíng)養(yǎng)成分的轉(zhuǎn)化以及土壤生物的生命活動(dòng)能力的強(qiáng)弱。土壤中的酶活性與土壤中各種代謝過(guò)程和能量轉(zhuǎn)換息息相關(guān)［36-37］，是土壤生物化學(xué)特征的重要組成部分。在評(píng)價(jià)土壤肥力、環(huán)境監(jiān)測(cè)、衡量土地利用等方面有廣泛的作用，可為土壤健康管理提供科學(xué)依據(jù)［38］。土壤中脲酶活性與土壤的微生物數(shù)量、土壤全氮、速效氮等密切相關(guān)［39］；蔗糖酶是一種重要水解酶，蔗糖酶斷裂蔗糖分子鍵后產(chǎn)生葡萄糖、果糖，為植物和微生物提供營(yíng)養(yǎng)的碳源［40］。土壤過(guò)氧化氫酶活性與土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動(dòng)相關(guān)，能有效防止過(guò)氧化氫的毒害，是重要的土壤微生態(tài)環(huán)境指示因子［40-42］。趙晶等［43］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期施用有機(jī)肥能夠增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量，并且與土壤脲酶、磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性呈相關(guān)性。接種類芽孢桿菌（Paenibacillus spp.）后土壤酶活性與植物的生物量呈正相關(guān)，能夠提高土壤質(zhì)量，同時(shí)具有促進(jìn)植物產(chǎn)量功能［44］。田間試驗(yàn)結(jié)果可看出，接種DS7（Bacillus amyloliquefaciens）后大蒜產(chǎn)量比對(duì)照組增產(chǎn)15.42%，接種DS7有助于提高產(chǎn)量。收集接種過(guò)DS7菌液的土壤和未做處理的對(duì)照組土壤，測(cè)定土壤中酶的活性，從過(guò)氧化氫酶活性指標(biāo)可看出，DS7可能會(huì)抑制土壤中某些細(xì)菌的生命活動(dòng)。但通過(guò)蔗糖酶活性及脲酶活性可看出，DS7可幫助土壤加快氨的轉(zhuǎn)化速率，改善土壤肥力，起到改良土壤的作用。因此，DS7具備多種功效，對(duì)大蒜根腐病病原真菌有良好的拮抗效果，在增產(chǎn)的同時(shí)可以改善土壤肥力，是一種良好的微生物肥料資源菌種。