劉 濱，劉新富，張躍峰，劉 晃，黃 濱，高瑩瑩,5

(1 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2 青島市魚類種子工程與生物技術重點實驗室，山東 青島266071；3 青島海星儀器有限公司，山東 青島 266000；4 中國水產(chǎn)科學研究院漁業(yè)機械儀器研究所，上海200092；5 上海海洋大學，水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

目前國內尚無對于石斑魚聽性腦干反應(auditory brainstem response,ABR)的研究報道，本研究利用自主構建的ABR檢測系統(tǒng)對珍珠龍膽石斑魚的聽覺閾值和聽頻范圍等指標進行檢測，研究結果將為研究水下噪聲對石斑魚類的潛在影響以及相應的環(huán)境優(yōu)化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

20條體長32～35 cm的珍珠龍膽石斑魚購自煙臺養(yǎng)殖基地，每次試驗前靜養(yǎng)2～3 d。麻醉試驗根據(jù)相關論文[3]進行了改進和優(yōu)化，采用背鰭基部注射加拉碘銨 (Gallamine triethiodide,購自Sigma-Aldrich公司)， 使用劑量為(1.25±0.13) μg/g 魚體質量，對試驗魚實施麻醉。在該劑量麻醉劑的作用下，麻醉狀態(tài)可持續(xù)2～3 h，且基本沒有全身性的肌肉收縮，排除了試驗過程中肌電的干擾。

1.2 儀器及ABR檢測系統(tǒng)的組成

試驗所用的ABR 檢測系統(tǒng)參照相關文獻[3-6]并進行了構建和優(yōu)化，所需儀器見表1，系統(tǒng)原理示意圖見圖1。水槽材質為有機玻璃，尺寸為120 cm×50 cm×50 cm，水下?lián)P聲器距水面25 cm。將水槽置于防震臺上，通過固定裝置將麻醉后試驗魚的身體基本沒于水槽水面以下，并使水位保持低于石斑魚頭蓋骨2 cm左右。在水槽中放置1臺小型循環(huán)加氧泵，通過軟管將富氧水流入魚口中，保證正常供氧。系統(tǒng)進行檢測時，首先使用醫(yī)療紗布蘸取蒸餾水擦拭魚的頭骨皮膚3～5次，待魚表皮干燥后采用固定于防震臺上的電極操縱器(WPI M3301,WPI)，將記錄電極精準定位于兩眼上頭骨中縫的聽神經(jīng)位置，參考電極定位于記錄電極前方兩眼中間的位置，兩個電極均插入皮下0.5～1 mm，記錄電極和參考電極接地后連接至生物電信號放大器(ISO-80,WPI)，在魚尾部肌肉中插入接地電極，以防止魚體肌電造成的干擾。

表1 主要試驗儀器Tab.1 The main experimental instrument

圖1 ABR 檢測系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of ABR detection system

1.3 參數(shù)設定

水下聲音信號由信號發(fā)生器(DG1022U，普源，中國)產(chǎn)生純短音信號，經(jīng)過前級和功率放大器(A-9030， 安橋，日本)將信號放大之后由水下?lián)P聲器給出。通過信號發(fā)生器設置聲音輸出模式，聲音信號時程根據(jù)頻率的不同設置為10～20 ms，間歇3 s，記錄時長50 ms，測試石斑魚100、200、300、500、800、1 000、1 500、2 000、3 000、5 000、10 000 Hz各頻率的AEP閾值(AEP單位為dB)。刺激信號聲強從高到低，以5 dB遞減，接近閾值時，每次減小2 dB，直至確定閾值。刺激聲強度由最高160 dB，再以5 dB依次遞減。濾波范圍為100 Hz～1 kHz，疊加1 000次[3]。聲壓水平(SPL)的校準和水下背景噪聲的記錄使用水下聲音記錄儀(Soudtrap 300HF，Ocean Instruments，新西蘭)和水聽器(中船重工726所自制，型號：RST-32，工作頻率范圍：20 Hz～50 kHz，低頻接收靈敏度：≥-202.7 dB)輔助完成，使用1 μPa為水下參考聲壓，測量實際聲壓并完成修正后得到正確聲壓值。

通過放大器將石斑魚的聽覺誘發(fā)電位(AEP)，放大10 000 倍后輸入四通道24位同步數(shù)據(jù)采集卡進行模數(shù)轉換，導入電腦，使用采集卡配套軟件記錄數(shù)據(jù)。每個頻率、每個強度的試驗過程均重復2次，以確定獲得的ABR 具有二次重復性，能夠獲得可重復ABR 波形的最小聲壓級，即為該頻率下的聽覺閾值。通過多次重復后對結果進行平均，能夠消除單次試驗誤差和環(huán)境噪聲信號的干擾。本研究在對試驗結果重復500次時,已經(jīng)能夠得到較理想的ABR曲線，最終選擇1 000 次重復作為本研究的最終結果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Clampfit 8.1軟件分析處理試驗中記錄的ABR數(shù)據(jù),通過Sigmaplot 12.0作圖和SPSS統(tǒng)計軟件(SPSS Inc.)進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 珍珠龍膽石斑魚ABR 波形特點

共對20 尾珍珠龍膽石斑魚進行了ABR 測試，結果顯示，20尾魚均對100 Hz～10 kHz純音有較明確的響應，且能夠記錄到放大后的AEP。在100 Hz～10 kHz的頻率范圍內，ABR 波形存在1個較明顯的負向主波峰和1個正向主波峰，如200 Hz 95 dB刺激下的ABR 波形(圖2)；并且在特定頻率范圍內還會在正向主波峰后伴隨1～3個小型正向波峰(圖3)。每個AEP信號的響應潛伏期為3～6 ms，并且響應潛伏期的時間會隨著刺激聲強度的增強而呈現(xiàn)縮短的趨勢，每增強10 dB，約縮短0.1～0.3 ms，但潛伏時間對于頻率的變化并不敏感 (圖3)。對照組的死亡石斑魚在同樣聲音刺激下，沒有記錄到AEP信號。

圖2 200 Hz的珍珠龍膽石斑魚的ABR 波形Fig.2 ABR waveform of Epinephelus fuscoguttatus ×Epinephelus lanceolatus at 200 Hz

圖3 不同頻率、聲強刺激下的珍珠龍膽石斑魚的ABR 波形Fig.3 ABR waveforms of Epinephelus ×Epinephelus under the stimulation of different frequencies and sound intensities

2.2 珍珠龍膽石斑魚的ABR聽覺閾值曲線

應用構建的ABR檢測系統(tǒng)，20條石斑魚在100～5 000 Hz的聽頻范圍內均記錄到短純音誘發(fā)的AEP信號，將每一頻率的閾值平均，繪制出魚在各頻率下的聽覺閾值曲線(圖4)。經(jīng)過分析，魚的最適聽頻范圍為100～2 000 Hz，最敏感的聲音頻率為300 Hz，聽覺閾值約為75.8 dB。

圖4 珍珠龍膽石斑魚聽覺閾值曲線Fig.4 Audiogram of Epinephelus fuscoguttatus

3 討論

3.1 魚類聽覺能力測定的方法

魚類的聽覺特性包括聽覺閾值、環(huán)境噪聲對魚類聽覺的遮蔽效果、音頻辨別能力、聲源定位能力、對學習音的記憶力等[7]。聽覺閾值是指魚類剛能聽到聲音的最小聲壓值,是魚類最基本的聽覺特性，目前對于魚類聽覺閾值進行測定的方法主要分為行為學、電生理學和神經(jīng)電位測量3種手段。行為學研究主要是根據(jù)魚類對聲音刺激的條件反射，判斷魚類對刺激聲音的反應以及閾值；電生理學研究是通過對魚進行馴化,將聲音刺激和電擊相結合，使魚對刺激產(chǎn)生條件反射,然后只采用聲音刺激并根據(jù)心電圖或鰓蓋運動的變化判斷魚對聲音的反應；神經(jīng)電位測量則通過采集魚的中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)出的動作電位，根據(jù)電位的變化判斷魚對聲音刺激的反應，測定魚類的聽覺閾值[8]。

采集聽性腦干反應(ABR)作為一種非侵入性的神經(jīng)電位研究方法，其原理是收集由聲音引起的第8神經(jīng)及腦干聽覺核的同步神經(jīng)電位[9-10]。ABR技術優(yōu)點是能夠實現(xiàn)無創(chuàng)傷、快速、反復測定聽力，對試驗魚大小無要求，能夠對不同種類魚類的聽覺進行研究[4]，但是ABR技術對試驗環(huán)境特別是電磁環(huán)境要求極其嚴格。試驗結果還經(jīng)常會受到背景環(huán)境噪聲的干擾,在不同環(huán)境下使用不同檢測儀器時，結果往往會有所差別[3]。盡管如此，憑借非侵入性檢測手段的巨大便利，聽性腦干反應(ABR)從1998年被應用于魚類聽力研究以來，該技術被迅速推廣[4,11]。國內魚類聽覺電生理研究發(fā)展較晚，目前研究水平還相對落后，該領域的報道還僅見于胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)、斑馬魚(Daniorerio)和褐菖鲉(Sebasticusmarmoratus)等淡水魚類[3,6,12]。

3.2 石斑魚類的聽覺閾值特征

目前,石斑魚屬魚類的聽覺研究資料十分匱乏,僅有1999年韓國科學家Yang等[13]采用心電圖(ECG)技術對七帶石斑魚(Epinephelusseptemfasciatus)的聽覺閾值進行了研究，在100～1 000 Hz的頻率范圍內，七帶石斑魚的聽覺曲線呈“U”形，其最佳聽覺頻率為350Hz，閾值為94.8 dB。本研究中，珍珠龍膽石斑魚的聽力曲線與報道的七帶石斑魚的聽力曲線十分相似，但最佳聽力頻率和閾值均有所不同，分析原因，可能既與試驗魚的大小、來源等有關，也與兩項研究中所采用的魚類聽覺檢測技術在性能上的差異有關。根據(jù)Takahito等[14]使用聽性腦干反應(ABR)和心電圖(ECG)技術測定鯉魚(Cyprinuscarpio)聽覺閾值的研究結果，ABR測得的最敏感頻率為505 Hz,而用ECG測得的最敏感頻率為1 000 Hz，盡管使用ABR技術和ECG技術得到的聽覺圖的形狀相似,但兩個圖中閾值水平有所不同。張旭光等[12]比較了褐菖鲉在行為聽覺和聽覺誘發(fā)電位反應的差異，發(fā)現(xiàn)行為聽覺獲得的敏感頻率范圍為80～300 Hz，其中對100 Hz聲音最為敏感,對應的聽覺閾值為90 dB，而ABR獲得的試驗結果為：敏感頻率范圍100～300 Hz，其中150 Hz為最敏感頻率，對應閾值為70 dB，行為聽覺曲線與聽覺誘發(fā)電位法所得到的褐菖鲉聽覺曲線基本相似。與鯉魚和褐菖鲉相似，本研究利用ABR技術獲得的珍珠龍膽石斑魚的最敏感聽覺頻率為300 Hz，閾值為75.8 dB，也低于采用ECG技術獲得的七帶石斑魚最佳聽覺頻率(350 Hz)和閾值(94.8 dB)的試驗結果，以上試驗結果能夠在一定程度上反映ABR和ECG技術的差異和各自特點。目前大多數(shù)魚類的ABR聽覺曲線為“U”形，如鯽魚(Carassiusauratus)[4]、橙鰭沙鰍(Botiamodesta)[15]、胭脂魚等[3]；少數(shù)魚類的ABR聽覺曲線為直線形，如地圖魚(Astronotuscellatus)[4]；極少數(shù)魚類呈現(xiàn)“W”形，如美洲鰣(Alosasapidissima)[16]。

3.3 石斑魚類的聽覺能力與其他魚類的比較

魚類的聽覺器官有兩種類型：一種與鰾不相連接；另一種與鰾相連接，使鰾成為聽覺器官的一部分，特別是鯉科魚類。有一個稱為魏勃氏器(Weberian apparatus)的器官，是由脊柱前端的數(shù)個骨所形成，借鰾連接內耳，具有聽骨的功用。鰾壁的振動，借著魏勃氏器的傳導而形成具有一定頻率與強度的波動，再傳入魚的內耳。通常認為，骨鰾魚類聽覺最敏感，非骨鰾類次之,無鰾類聽覺能力較差，有鰾魚類相比無鰾魚類具有更寬的聽頻范圍和更低的聽力閾值[6]。因此，可以認為鰾不僅使魚類聽覺敏銳，也扮演著擴大聲音頻率范圍的角色[17]。劉猛等[3]研究發(fā)現(xiàn)，胭脂魚的聽頻范圍為100～5 000 Hz,100～2 000 Hz范圍敏感度較高,800 Hz最敏感,聽覺閾值約69.8 dB。Kenyon等[4]研究發(fā)現(xiàn)金魚(Carassiusauratus)的聽頻范圍為100～5 000 Hz，最低閾值為64.0 dB。鰱(Hypopthalmichthysmolitrix)和鳙(Aristichthysnobilis)的聽頻范圍為100～3 000 Hz，鰱的最低閾值為104.2 dB,鳙的最低閾值為105.7 dB[18]。石斑魚類作為一種有鰾魚類，其聽頻范圍為100～5 000 Hz,最適聽頻范圍為100～2 000 Hz，這一范圍基本與大多數(shù)魚類的聽覺頻率接近，屬于低頻聲響。有鰾的杜父魚(Pseudoblenniuscottoides)的聽頻范圍為40～6 000 Hz，而Mann等[16,19]研究發(fā)現(xiàn)鯡形目的美洲鰣(Alosasapidissima)和大鱗油鯡(Brevoortiapatronus)甚至可以聽到高達180 kHz的超聲波。底棲無鰾的牙鲆(Paralichthysolivacues)則對60～200 Hz 的低頻音較敏感，最敏感頻率為100 Hz，其聽覺閾值為(94±1.5) dB[20]。而沒有韋伯氏器的魚類,如鱸形目魚類，蝦虎魚(Gobiuscruentatus) 閾值均高于108 dB，而且聽頻范圍窄,不超過1 000 Hz[21]。

3.4 麻醉劑對魚類ABR研究結果的影響

在檢測魚類腦干電信號的過程中，使用不同類型的麻醉劑以及不同劑量會對試驗結果產(chǎn)生影響。潘豪來等[6]采用0.01%和0.1%的三卡因甲基磺酸鹽(MS-222)對斑馬魚進行短暫麻醉和深度麻醉后，應用AEP檢測系統(tǒng)記錄不同時間點的AEP，結果表明，過度麻醉會導致響應波形潛伏期延長、幅值下降，相反，麻醉程度變淺后所記錄的斑馬魚響應波形潛伏期縮短、幅值升高。而Kenyon等[4]發(fā)現(xiàn)使用加拉碘銨作為麻醉劑不會對金魚ABR產(chǎn)生影響。Yan等[22]、Cordova等[23]的研究也證實使用加拉碘銨作為麻醉劑不會對魚類的ABR產(chǎn)生影響。根據(jù)以上研究報道，本試驗中也將加拉碘銨作為珍珠龍膽石斑魚的麻醉劑，并根據(jù)魚體質量和預試結果對使用的劑量進行優(yōu)化，也為今后開展更大規(guī)格石斑魚以及其他大型海洋游泳性魚類的麻醉劑劑量使用提供參考。

4 結論

石斑魚是中國沿海養(yǎng)殖的高值魚類代表，屬于趨觸性巖礁魚類，喜棲息于魚礁孔隙中，特別的生活習性使其既適合于工廠化高密度養(yǎng)殖，也適合于人工魚礁增殖。隨著近年來石斑魚人工繁殖和養(yǎng)殖技術的突破，石斑魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，池塘、網(wǎng)箱、陸海接力、工廠化循環(huán)水、深遠海養(yǎng)殖工船等養(yǎng)殖模式不斷涌現(xiàn)。本研究建立的珍珠龍膽石斑魚聽性腦干反應(ABR)檢測系統(tǒng)和初步獲取的聽覺閾值，以及珍珠龍膽石斑魚的聽性腦干反應(ABR)聽覺曲線能夠為研究噪聲對不同養(yǎng)殖模式下石斑魚的動物福利提供重要的試驗數(shù)據(jù)，在下一步研究中還需要對ABR檢測系統(tǒng)進行改進和優(yōu)化，提高檢測系統(tǒng)的抗干擾能力和穩(wěn)定性。與此同時，也需要對不同體型和不同生長階段的石斑魚進行研究，如石斑魚苗種和親魚等，以更好地評估噪聲對養(yǎng)殖石斑魚健康生長的影響。

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