高 婧，李彩艷,2，李可馨，彭夢(mèng)雪，梁志宏,*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河南省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，河南 鄭州 450000）

赭曲霉（Aspergillus ochraceus）是一種廣泛分布于糧食和飼料中的絲狀真菌，可以產(chǎn)生有害次級(jí)代謝產(chǎn)物赭曲霉毒素。目前已發(fā)現(xiàn)超過20 種赭曲霉毒素，其中赭曲霉毒素A（ochratoxins A，OTA）分布最廣、危害最大[1]。OTA廣泛污染谷物、豆類、葡萄、咖啡等農(nóng)副產(chǎn)品[2]，可以引起人類和動(dòng)物的肝臟、腎臟損傷，并有致畸、致突變、致癌和免疫抑制作用[3]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為2B類致癌物，在已知的真菌毒素中，OTA的危害性僅次于黃曲霉毒素[4]。中國、美國、加拿大、澳大利亞、日本、韓國等國家，以及國際食品法典委員會(huì)和歐盟等國際組織發(fā)布的有關(guān)食品中真菌毒素法規(guī)中都對(duì)OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)做出了要求[5]。

近年來在莢膜組織胞漿菌（H i s t o p l a s m a capsulatum）[6]、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）[7]、黃曲霉（Aspergillus flavus）[8]等真菌中發(fā)現(xiàn)，真菌能夠通過群體感應(yīng)信號(hào)調(diào)控機(jī)制，調(diào)節(jié)其生長發(fā)育和真菌毒素產(chǎn)生。群體感應(yīng)是微生物調(diào)節(jié)群體行為的信號(hào)交流機(jī)制，微生物可以生產(chǎn)特定的小分子物質(zhì)（成為群體感應(yīng)信號(hào)分子）并分泌到胞外，當(dāng)胞外信號(hào)分子在局部環(huán)境中積累達(dá)到一定的水平時(shí)，可以進(jìn)入其他微生物細(xì)胞內(nèi)激活特定基因的表達(dá)，從而調(diào)控菌群生理功能，以適應(yīng)周圍環(huán)境的改變[9-10]。群體感應(yīng)機(jī)制在細(xì)菌中十分普遍，細(xì)菌通過群體感應(yīng)機(jī)制控制其群體行為，如生物發(fā)光、毒力因子分泌和生物膜的形成等，從而在種群競(jìng)爭中占據(jù)優(yōu)勢(shì)[9]。霉菌中也存在類似于細(xì)菌群體感應(yīng)的密度調(diào)節(jié)機(jī)制，黃曲霉[11]及赭曲霉[12]在侵染脂肪酸含量高的作物時(shí)更容易產(chǎn)生毒素，這表明脂肪酸類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物可能參與了真菌群體感應(yīng)的調(diào)控。

真菌中已發(fā)現(xiàn)的群體感應(yīng)信號(hào)分子主要有氧脂素、法尼醇、γ-丁內(nèi)脂[10]，其中氧脂素是多不飽和脂肪酸通過酶促或非酶促反應(yīng)加氧產(chǎn)生的一類脂氧合物，是霉菌、酵母菌、植物和動(dòng)物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要信號(hào)分子，可以調(diào)節(jié)真菌的無性和有性發(fā)育之間的平衡，影響真菌毒素的合成[13]。植物來源的亞油酸氧化產(chǎn)物如羥基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecaenoic acid，HODE）、氫過氧化十八碳二烯酸（hydroperoxyoctadecadienoic a c i d，H P O D E）和氫過氧化十八碳三烯酸（hydroperoxyoctadecatrienoic acid，HPOTE）等可以影響黃曲霉和構(gòu)巢曲霉的營養(yǎng)生長、分生孢子、菌核的形成及真菌毒素的合成[14-15]。13S-HPODE和13S-HPOTE可以抑制黃曲霉毒素合成，9S-HPODE能夠促進(jìn)黃曲霉毒素合成[16]，13S-HPODE可以促進(jìn)分生孢子的產(chǎn)生而9S-HPODE可以促進(jìn)子囊孢子的產(chǎn)生[17]。隨著群體密度的增加，黃曲霉逐漸實(shí)現(xiàn)從菌核到分生孢子的轉(zhuǎn)換，而當(dāng)敲除黃曲霉的脂氧化酶基因lox后菌體不能正常產(chǎn)生氧脂素，當(dāng)孢子接種密度大于105個(gè)/mL時(shí)菌核數(shù)目增加而分生孢子數(shù)目減少[18]。與黃曲霉類似，氧脂素也可以調(diào)節(jié)赭曲霉的形態(tài)和毒素產(chǎn)生，赭曲霉AoloxA基因產(chǎn)物脂氧合酶能夠催化亞油酸發(fā)生加氧反應(yīng)，生成脂過氧化物9S-HODE和13S-HODE，影響赭曲霉形態(tài)及OTA的合成，Reverberi等[19]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)敲除赭曲霉菌株的lox基因后，與野生型相比，突變的Delta AoloxA菌株氧脂素水平降低，形成的分生孢子數(shù)減少，菌核數(shù)目增加，OTA合成受到抑制。Punelli等[20]使用水楊基異羥肟酸和白藜蘆醇（一種脂氧合酶抑制劑）作用于赭曲霉菌株，發(fā)現(xiàn)脂肪氧合酶活性的降低導(dǎo)致OTA產(chǎn)量明顯減少，Antonioletti等[21]證明了能夠控制OTA生物合成的化合物也顯著抑制lox的活性。說明氧脂素在控制赭曲霉OTA生物合成中起主要作用。

赭曲霉的生長發(fā)育和OTA合成受到群體密度調(diào)控[12]，但具體的群體感應(yīng)信號(hào)分子及其調(diào)控機(jī)制尚不明確，氧脂素可能是赭曲霉的群體感應(yīng)信號(hào)分子之一。因此本實(shí)驗(yàn)擬探究氧脂素9S-HODE和13S-HODE是否為赭曲霉群體感應(yīng)信號(hào)分子及其對(duì)赭曲霉生長發(fā)育和OTA合成的作用，旨在闡明氧脂素在赭曲霉生長發(fā)育和毒素產(chǎn)生中所起的作用，豐富赭曲霉的毒素合成調(diào)控機(jī)理研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赭曲霉AS3.4412購自中科院微生物所，－80 ℃超低溫冰箱保存；小麥產(chǎn)自河南省洛陽市；玉米產(chǎn)自河南省焦作市；花生產(chǎn)自吉林省遼源市；大豆產(chǎn)自黑龍江省綏化市。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯（potato dextrose broth，PDB）培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；赭曲霉毒A殘留酶聯(lián)免疫試劑盒 北京勤邦生物技術(shù)有限公司；吐溫20國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純） 美國J.T.Baker化學(xué)試劑有限公司；甲醇（色譜純） 中國賽默飛世爾科技有限公司；甲酸（色譜純） 北京化工廠；9S-HODE、13S-HODE 美國Cayman化學(xué)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multiscan Ascent酶標(biāo)儀 美國Thermo公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5804R低溫高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；普通光學(xué)顯微鏡 南寧松景天倫生物科技有限公司；ALPHA 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；SANYO MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋 江蘇省科學(xué)器材有限公司；1200-6410B高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 赭曲霉在不同孢子接種密度下的液體培養(yǎng)

赭曲霉AS3.4412菌株活化后選取長勢(shì)較好的菌落，挑取少許菌絲，接種在PDA培養(yǎng)皿的中央，于霉菌培養(yǎng)箱28 ℃倒置培養(yǎng)6 d后，可觀察到PDA培養(yǎng)皿表面長滿赭色孢子，將孢子刮下置于0.9% NaCl（含0.01%吐溫20）中，紗布過濾后取孢子濾液。血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后將孢子密度稀釋至107個(gè)/mL和104個(gè)/mL，取2.5 mL孢子懸液分別加入22.5 mL PDB培養(yǎng)基中，使得PDB液體培養(yǎng)基中孢子的最終密度分別為106個(gè)/mL和103個(gè)/mL，于28 ℃搖床培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的3、4、5、6 d取樣測(cè)定9S-HODE、13S-HODE和OTA含量。

1.3.2 赭曲霉PDA培養(yǎng)皿中氧脂素的添加

打孔器裁下直徑1 cm的圓形濾紙片后滅菌，將9S-HODE和13S-HODE標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇稀釋，終質(zhì)量濃度1 μg/mL，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾除菌后浸透濾紙片，待其干燥后鋪在接種了赭曲霉孢子的平板中央。添加氧脂素的赭曲霉PDA培養(yǎng)皿于28 ℃培養(yǎng)6 d，觀察赭曲霉菌落形態(tài)，之后以濾紙片為中心，將濾紙片周圍直徑為3 cm范圍內(nèi)的赭曲霉孢子刮下計(jì)數(shù)；另以濾紙片為中心，將濾紙片周圍直徑為3 cm范圍內(nèi)的培養(yǎng)基取出，提取培養(yǎng)基中的OTA測(cè)定含量。

1.3.3 赭曲霉中氧脂素含量的測(cè)定

PDB液體培養(yǎng)基中分離赭曲霉菌絲球，于－80 ℃冷凍8 h后用真空冷凍干燥機(jī)干燥24 h。將凍干后的菌絲球在液氮中均質(zhì)，用氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液抽提菌絲球2 次，取氯仿層；在1 mL的氯仿的體系中加入2 mg三苯基膦作為抗氧化劑；氮?dú)獯蹈桑?00 μL甲醇重溶后過0.22 μm有機(jī)濾膜除去大顆粒雜質(zhì)，采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定氧脂素含量。

色譜條件：采用等度洗脫，流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸溶液90∶10（V/V）；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；色譜柱采用Agilent Eclipse plus C18柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm），柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源負(fù)離子模式；串聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器；離子源溫度100 ℃；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速8.0 min；霧化氣壓力35.0 psi；碎裂電壓為135 V；檢測(cè)方式選擇多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

1.3.4 赭曲霉培養(yǎng)基中OTA含量的測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫試劑盒法測(cè)定OTA含量。取液體培養(yǎng)基置于離心管中，調(diào)pH 1～2，加1 mL三氯甲烷混勻，10 000×g離心5 min后取下層有機(jī)清液于新的離心管，氮?dú)獯蹈珊蠹? mL甲醇復(fù)溶。酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)OTA含量，根據(jù)需要量將濃縮酶結(jié)合物用結(jié)合物稀釋液稀釋，微孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，然后加入酶結(jié)合物工作液避光反應(yīng)，去離子水洗板4～5 次，顯色5 min后加入終止液，最后使用酶標(biāo)儀于波長450 nm處測(cè)定每孔OD值。

1.3.5 赭曲霉對(duì)種子的侵染

將選取的種子用7 5%乙醇溶液消毒1 m i n，0.05% NaClO溶液消毒3 min，無菌水沖洗數(shù)次，將種子用滅菌的的紗布擦干，置于三角瓶中。稱取200 g種子浸沒在200 mL無菌水（CK）或孢子懸浮液中，搖床200 r/min搖30 min，過濾后種子放入錐形瓶，于28 ℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7 d。

1.3.6 種子發(fā)芽率的計(jì)算

發(fā)芽率是指在規(guī)定的條件和時(shí)間內(nèi)長成的正常幼苗數(shù)占供檢驗(yàn)種子數(shù)的百分率。測(cè)定方法參照GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽試驗(yàn)》，隨機(jī)數(shù)取3 組試樣：花生、大豆、玉米種子以50 粒為一組（50×3），小麥種子以100粒為一組（100×3）。無菌水浸種24 h之后均勻排列在墊有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，將濾紙浸濕，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，花生、大豆、玉米、小麥的培養(yǎng)時(shí)間分別為5、5、4、4 d。種子發(fā)芽率的計(jì)算公式如下，結(jié)果用3 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值表示。

式中：M1為全部正常發(fā)芽粒數(shù)；M為供試種子粒數(shù)。

1.3.7 糧食營養(yǎng)成分的測(cè)定

為分析赭曲霉侵染糧食后，花生、大豆、玉米和小麥的營養(yǎng)成分損失情況，依據(jù)國標(biāo)方法測(cè)定脂肪（GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》）、蛋白質(zhì)（GB/T 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》）、VB1（GB/T 5009.84—2016《食品中維生素B1的測(cè)定》）、VE（GB/T 5009.82—2016《食品中維生素E的測(cè)定》）的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用IBM SPSS V 20.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，平均值的差異性用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的最小顯著性差異法檢驗(yàn)分析，P＜0.05，差異顯著。數(shù)值用表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。統(tǒng)計(jì)分析圖采用Microsoft Office Excel 2016繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體密度對(duì)赭曲霉的氧脂素和OTA產(chǎn)量的影響

為明確赭曲霉的群體密度對(duì)9S-HODE和13S-HODE及OTA產(chǎn)量的影響，測(cè)定赭曲霉在低密度群體（初始孢子接種密度103個(gè)/mL）和高密度群體（初始孢子接種密度106個(gè)/mL）中9S-HODE、13S-HODE和OTA的產(chǎn)量變化，結(jié)果如圖1所示。9S-HODE和13S-HODE分別可以促進(jìn)和抑制黃曲霉中毒素的產(chǎn)生[22]，故用9S-HODE/13SHODE分析其對(duì)OTA產(chǎn)量的影響。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間和接種密度對(duì)赭曲霉的氧脂素（A）和OTA產(chǎn)量（B）的影響Fig. 1 Effects of culture time and inoculum density on ochratoxin (A)and OTA yield (B)

低群體密度的赭曲霉所產(chǎn)9S-HODE/13S-HODE比值高于高群體密度的赭曲霉，并產(chǎn)生更多的OTA。接種后赭曲霉產(chǎn)生9S-HODE/13S-HODE的比值在不斷下降，初始接種密度為103個(gè)/mL的赭曲霉9S-HODE/13S-HODE比值開始時(shí)高于106個(gè)/mL的赭曲霉，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長二者趨于一致（圖1A）。低群體密度赭曲霉的OTA產(chǎn)量高于高群體密度赭曲霉，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長逐漸趨于一致（圖1B）。

在低群體密度（103個(gè)/mL）構(gòu)巢曲霉中添加氧脂素，青霉素的產(chǎn)量提高[7]；在黃曲霉中添加脂氧合物13S-HPODE明顯抑制黃曲霉毒素合成，加入9S-HPODE促進(jìn)黃曲霉毒素合成[23]。微生物產(chǎn)生特定的小分子化學(xué)物質(zhì)并分泌到胞外，當(dāng)胞外信號(hào)分子在局部環(huán)境中積累達(dá)到一定水平時(shí)，可以進(jìn)入其他微生物細(xì)胞內(nèi)激活特定基因的表達(dá)，從而調(diào)控群體行為適應(yīng)環(huán)境的變化[16]，這種通過密度依賴機(jī)制調(diào)節(jié)生物行為的機(jī)制最早在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，稱為群體感應(yīng)。實(shí)驗(yàn)推測(cè)在赭曲霉中氧脂素9S-HODE和13S-HODE作為信號(hào)分子調(diào)控OTA產(chǎn)量。

2.2 添加9S-HODE、13S-HODE對(duì)赭曲霉生長發(fā)育和OTA產(chǎn)量的影響

為進(jìn)一步分析氧脂素對(duì)赭曲霉生長發(fā)育和OTA產(chǎn)生的影響，在赭曲霉PDA培養(yǎng)基中外源添加9S-HODE和13S-HODE，觀察赭曲霉菌落生長，測(cè)定產(chǎn)生的孢子數(shù)和OTA的產(chǎn)量。添加9S-HODE抑制赭曲霉菌落生長和孢子生成，促進(jìn)OTA的產(chǎn)生；添加13S-HODE促進(jìn)赭曲霉菌落生長和孢子生成，抑制OTA產(chǎn)生。觀察菌落數(shù)量和形態(tài)，添加乙醇的對(duì)照組未顯示出明顯的促進(jìn)或抑制菌落生長的作用，添加9S-HODE的濾紙周圍菌落生長量最少，添加13S-HODE的濾紙周圍長出了較多菌落（圖2A）。計(jì)數(shù)結(jié)果與平板上觀察到的現(xiàn)象相符，孢子產(chǎn)量：13S-HODE組（7×107個(gè)）＞乙醇對(duì)照組（5×107個(gè)）＞9S-HODE組（4×107個(gè)），說明9S-HODE確實(shí)抑制赭曲霉孢子產(chǎn)生，13S-HODE促進(jìn)赭曲霉孢子產(chǎn)生（圖2B）。測(cè)定OTA產(chǎn)量，9S-HODE組（90 ng/mL）＞乙醇對(duì)照組（60 ng/mL）＞13S-HODE組（35 ng/mL），表明9S-HODE可以促進(jìn)OTA的產(chǎn)生，而13S-HODE可以抑制OTA的產(chǎn)生（圖2C）。

圖2 添加9S-HODE和13S-HODE對(duì)赭曲霉菌落生長（A）、孢子數(shù)（B）、OTA產(chǎn)量（C）的影響Fig. 2 Effects of addition of 9S-HODE and 13S-HODE on colony growth (A), spore number (B), and OTA production (C) of A. ochraceus

Brown等[8]研究發(fā)現(xiàn)，氧脂素作為群體感應(yīng)的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)黃曲霉生長發(fā)育和黃曲霉毒素產(chǎn)生。在黃曲霉培養(yǎng)基中外源加入13S-HPODE會(huì)抑制黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）合成，促進(jìn)黃曲霉孢子產(chǎn)生；加入9S-HPODE會(huì)促進(jìn)AF合成，抑制黃曲霉孢子產(chǎn)生[22]。氧脂素對(duì)赭曲霉與黃曲霉的生長發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物影響類似，推測(cè)氧脂素作為赭曲霉的群體感應(yīng)信號(hào)分子影響赭曲霉的生長發(fā)育和OTA產(chǎn)量，9S-HODE抑制赭曲霉孢子生成，促進(jìn)OTA的產(chǎn)生；13S-HODE促進(jìn)赭曲霉孢子生成，抑制OTA產(chǎn)生。

2.3 不同群體密度赭曲霉孢子侵染糧食規(guī)律

2.3.1 赭曲霉侵染對(duì)糧食發(fā)芽率的影響

為研究不同密度群體赭曲霉對(duì)花生、大豆、玉米、小麥等大宗農(nóng)作物的侵染能力，測(cè)定赭曲霉侵染后的種子發(fā)芽率（圖3）。從被103、106個(gè)/mL的赭曲霉孢子懸浮液侵染的花生、大豆、玉米中挑選出種子50 粒，從小麥中挑出種子100 粒進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。侵染濃度106個(gè)/mL的赭曲霉比103個(gè)/mL的赭曲霉對(duì)糧食發(fā)芽的損傷更大。低密度赭曲霉侵染后花生、大豆、玉米、小麥發(fā)芽率分別下降了29%、21%、17%、14%；高密度赭曲霉侵染后花生、大豆、玉米、小麥發(fā)芽率分別下降了35%、29%、20%、22%，赭曲霉侵染可能對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)含量高的作物如花生、大豆的危害更大。脂類物質(zhì)與氧脂素的生物合成有密切的關(guān)系，植物來源的亞油酸氧化產(chǎn)物可以影響曲霉的營養(yǎng)生長、分生孢子、菌核的形成及真菌毒素的合成[14-15]，赭曲霉對(duì)糧食的侵染可能受到氧脂素的調(diào)控。

圖3 花生、大豆、玉米和小麥被不同孢子密度赭曲霉侵染后的生長情況（A）和發(fā)芽率（B）Fig. 3 Growth (A) and germination rate (B) of peanut, soybean, corn and wheat infected with different spore densities of A. oryzae

植物氧脂素和曲霉屬真菌氧脂素在生理作用上有相似性，植物中催化脂肪酸形成氧脂素的酶是脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX），LOX的主要作用是催化含有順,順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸（如亞油酸、亞麻酸及花生四烯酸等）進(jìn)行加氧反應(yīng)，氧原子可添加在亞油酸碳?xì)滏湹牡?或第13位的碳原子上，從而形成9S、13S脂肪酸氫過氧化物（9S-HPODE、13S-HPODE），它們影響黃曲霉侵染作物種子過程中黃曲霉的生長、孢子產(chǎn)生以及黃曲霉毒素的生物合成[24]。黃曲霉侵染玉米和花生種子，誘導(dǎo)種子中編碼9-LOX的基因表達(dá)上調(diào)，9S-HPODE含量增加，黃曲霉毒素產(chǎn)量增加[25]。發(fā)現(xiàn)黃曲霉侵染對(duì)脂肪含量高的作物危害更大，推測(cè)是作物本身產(chǎn)生的9S-HPODE會(huì)誘使黃曲霉產(chǎn)生更多的黃曲霉毒素，同時(shí)促進(jìn)有性孢子產(chǎn)生[16]。本研究發(fā)現(xiàn)赭曲霉的侵染規(guī)律同黃曲霉，從另一個(gè)角度驗(yàn)證氧脂素影響赭曲霉生長發(fā)育和次級(jí)代謝產(chǎn)物生成。

2.3.2 糧食受赭曲霉侵染后的營養(yǎng)成分分析

為測(cè)定赭曲霉侵染對(duì)糧食的損傷程度，進(jìn)行赭曲霉侵染后糧食的營養(yǎng)成分分析。密度分別為103個(gè)/mL和106個(gè)/mL的赭曲霉孢子接種到花生、大豆、玉米和小麥上，未被侵染的種子作為對(duì)照，分析糧食營養(yǎng)成分的變化（圖4）。發(fā)現(xiàn)赭曲霉侵染種子后蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、水分、VB1、VE等指標(biāo)中，VE下降最顯著（P＜0.05），103個(gè)/mL和106個(gè)/mL的赭曲霉孢子侵染后的花生、大豆、玉米和小麥VE分別下降了50%、27%、8%、25%和40%、59%、11%、46%。

圖4 不同接種量赭曲霉侵染后糧食營養(yǎng)成分分析Fig. 4 Nutritional analysis of grains infected with different inoculum concentrations of A. ochraceus

VE普遍存在于植物體內(nèi)，是一種能阻斷自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的抗氧化劑。真菌侵染宿主后，宿主產(chǎn)生活性氧作為防御武器[26]，誘導(dǎo)真菌細(xì)胞死亡，而真菌病原體產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物來抵抗氧化應(yīng)激壓力，如黃曲霉中黃曲霉毒素[27]、禾谷鐮刀菌中的單萜烯B[28]、赭曲霉中的OTA[29]的積累，這是真菌與植物宿主互作所產(chǎn)生的適應(yīng)性機(jī)制。推測(cè)被侵染的種子營養(yǎng)成分中具有抗氧化活性的VE損失最多就是赭曲霉侵染導(dǎo)致宿主氧化應(yīng)激壓力增大，生成活性氧，導(dǎo)致具抗氧化活性的VE含量下降。

3 結(jié) 論

本研究探討了9S-HODE和13S-HODE對(duì)赭曲霉生長發(fā)育和OTA產(chǎn)生的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)赭曲霉群體密度可以影響9S-HODE、13S-HODE及OTA合成，在低密度群體下產(chǎn)生的9S-HODE/13S-HODE比值高于高群體密度，產(chǎn)生更多的OTA。9S-HODE抑制赭曲霉菌落生長和孢子產(chǎn)生，促進(jìn)OTA產(chǎn)生，而13S-HODE促進(jìn)赭曲霉菌落生長和孢子產(chǎn)生，抑制OTA產(chǎn)生，表明外源添加氧脂素可以影響赭曲霉孢子產(chǎn)生和OTA合成。赭曲霉對(duì)油料作物如花生和大豆的侵染程度強(qiáng)于玉米和小麥。群體密度可以影響赭曲霉氧脂素和OTA的產(chǎn)生，氧脂素9S-HODE和13S-HODE可能作為赭曲霉的群體感應(yīng)的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)赭曲霉的生長發(fā)育和OTA的產(chǎn)量，脂肪和蛋白質(zhì)含量高的糧食種子可能更易受到赭曲霉的侵染。群體感應(yīng)可能是OTA合成的調(diào)控機(jī)理之一，明確氧脂素在赭曲霉生長發(fā)育和毒素產(chǎn)生中所起的作用，可以豐富赭曲霉的毒素合成調(diào)控機(jī)理的研究。