龔仕玲 謝冬梅 李英文 陳啟亮

(重慶師范大學生命科學學院, 重慶市高校動物生物學重點實驗室, 重慶 401331)

鎘(Cd)是一種非必需、難降解的重金屬元素,由于其具有良好的穩(wěn)定性和防腐性, 一直以來被廣泛應用于電池、油漆及染料等工業(yè)生產[1]。自20世紀50年代日本居民因食用“鎘米”而引發(fā)“痛痛病”事件以來, Cd污染對人體健康的危害逐漸受到全世界的關注。水環(huán)境Cd污染主要來自含Cd廢水的直接排放, 以及金屬開采、冶煉等導致Cd在環(huán)境介質中積累, 并經雨水淋溶后進入水體[2]。通常, 自然水體中Cd濃度低于500 ng/L[3], 但我國部分污染水域Cd濃度遠超過該值, 例如: 武漢東湖Cd濃度達8 μg/L[4], 山東省招遠市玲瓏金礦區(qū)Cd濃度高達194.5 μg/L[5]。魚類長期暴露于Cd污染的水體中, 可導致體內Cd蓄積, 引起應激反應, 導致滲透壓失衡[6]。胚胎暴露于Cd中會導致孵化率減少, 仔魚Cd暴露會誘導畸形甚至死亡[7]。此外, Cd還能影響魚體的能量代謝, 改變運動行為, 干擾內分泌系統(tǒng)[6, 8], 威脅魚類的生存和生長, 并通過食物鏈危害人體健康。

鰓不僅是魚類最主要的呼吸器官, 也是滲透壓調節(jié)、酸堿平衡以及含氮廢物排出的重要部位[9, 10]。因而, 維持鰓的正常結構和功能對于魚類的代謝活動十分重要。然而, 魚鰓直接暴露于水體中, 是有毒物質攻擊的主要靶器官, 對水環(huán)境污染物尤為敏感, 其結構和功能的改變可反映水環(huán)境的變化, 因此可作為環(huán)境污染的指示器官[9, 11, 12]。截至目前,國內外已有一些關于水體Cd暴露影響魚類鰓的結構及功能的研究報道[13, 14], 但這些研究大多關注Cd對魚類的急性毒性效應, 而環(huán)境劑量Cd暴露下魚類鰓的組織學改變及抗氧化反應的研究相對缺乏。此外, 關于Cd暴露誘導鰓的免疫調節(jié)的研究未見報道。

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)俗稱黃臘丁,是一種底棲小型雜食性魚類, 為我國重要的名優(yōu)養(yǎng)殖品種之一[15]。本研究以黃顙魚為對象, 將其暴露于50和200 μg/L Cd2+水體8周后, 分析鰓的組織學結構、抗氧化狀態(tài)以及免疫相關基因的表達水平, 旨在揭示Cd對魚類的毒理效應及毒理機制, 為水體重金屬污染風險評價提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

氯化鎘(CdCl2)為分析純, 硝酸為優(yōu)級純, 均購自國藥集團化學試劑有限公司; 抗氧化指標分析試劑盒購自南京建成生物工程研究所; RNA提取、逆轉錄及熒光定量試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 實驗設計

黃顙魚購自重慶當?shù)仞B(yǎng)殖場, 將其轉移至室內養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行為期2周的暫養(yǎng)。在實驗開始時,選取180尾規(guī)格一致的健康魚(平均體重為6.26 g)隨機放入9個盛有200 L水的養(yǎng)殖缸中, 每缸20尾。然后, 向缸中加入已配好的CdCl2母液(對照組不加),使之分別暴露在Cd2+濃度理論值為0 (對照組)、50 μg/L(低劑量組)和200 μg/L(高劑量組)的水體中,每個濃度設置3個平行缸。不同實驗組對應的實測值分別為(0.23±0.09)、(55.22±3.10)和(184.58±7.66) μg/L。在養(yǎng)殖期間, 每天投喂商業(yè)飼料2次(10:00和16:00), 投喂率為魚體重的4%。此外, 為保持水質良好, 每天換水50%, 并補充相應的Cd2+。水質參數(shù)為: 水溫(25.1±0.8)℃, pH 7.6±0.1, 溶氧(16.4±0.2) mg/L。光暗比為14h∶10h, 暴露時間為8周。

在暴露結束后, 黃顙魚經MS-222麻醉后, 置于冰面上解剖獲取鰓組織, 經PBS沖洗后分成3份: 一份浸入波恩氏液中固定, 用于組織學觀察; 另一份經液氮速凍后儲存在-80℃用于抗氧化指標和基因表達分析; 其余部分保存在-80℃用于Cd含量測定。

1.3 Cd含量測定

使用石墨爐原子吸收分光光度法檢測鰓中Cd含量。首先, 將樣品置于80℃烘箱中烘干至恒重后,稱取約0.5 g樣品, 加入10 mL濃硝酸, 置于消解罐中消解至冒白煙(消化液呈無色透明)。然后, 將消解液轉移至容量瓶中定容, 并稀釋至適宜濃度, 用石墨爐原子吸收分光光度計(島津AA-6880)測定Cd含量。

1.4 組織學分析

鰓組織用波恩氏液固定24h后, 放入梯度乙醇中脫水。經二甲苯透明后, 放入石蠟中包埋。將包埋材料進行常規(guī)切片, 切片厚度為5 μm。采用蘇木精-伊紅(HE)染色, 中性樹膠封片后拍照觀察。

1.5 抗氧化指標分析

使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定以下抗氧化指標: 還原型谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫(H2O2)的含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、抗羥自由基(AHR)的活性。測定時, 取鰓組織約0.5 g, 按1∶10 (w/v)加入預冷的生理鹽水, 在冰上充分勻漿。然后, 將勻漿液轉移至離心管中, 于4℃ 3000×g離心15min, 取上清液立即用于分析。分析方法嚴格按照試劑盒說明書進行。上清液的蛋白濃度以牛血清蛋白(BSA)為標準品, 采用考馬斯亮藍法測定。

1.6 基因表達分析

使用RNAiso Plus提取鰓組織總RNA?？俁NA的質量和濃度分別用1%瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(Nanodrop ND-2000)檢測。然后, 取1 μg總RNA, 用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒合成第一鏈cDNA。

采用CFX96實時定量PCR儀(Bio-Rad)檢測基因的表達水平。10 μL反應體系為: SYBR Premix ExTaqTM5 μL, 上下游引物各0.4 μL (10 μmol/L),cDNA 1 μL, 無RNA酶水3.2 μL。反應程序為: 95℃30s, 95℃ 5s、60℃ 30s、72℃ 30s (40個循環(huán)), 并添加熔解曲線(60℃至95℃, 每升高0.5℃檢測一次熒光信號值)?；虻南鄬Ρ磉_量用2-ΔΔCt計算, 內參基因為18S rRNA。引物序列見表 1。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Tukey多重檢驗, 當P＜0.05時視為差異顯著。柱形圖用GraphPad Prism 6進行繪制。

2 結果

2.1 Cd2+暴露對鰓中Cd含量的影響

如圖 1所示, 隨著水體Cd2+濃度升高, 鰓中Cd含量逐漸上升, 且高劑量組鰓中Cd含量顯著高于對照組(P＜0.05)。低劑量組(47.5±13.5) μg/kg和高劑量組(174.6±8.8) μg/kg鰓中Cd含量分別是對照組(17.3±5.0) μg/kg的2.7倍和10.1倍。

2.2 Cd2+暴露對鰓組織學的影響

如圖 2所示, 對照組鰓組織結構正常, 表現(xiàn)為鰓絲結構完整, 外層上皮細胞膜平滑, 毛細血管、柱細胞和上皮細胞形態(tài)正常(圖 2A)。在低劑量組中,可見明顯的組織學病變, 包括動脈瘤、細胞增生和鰓小片彎曲(圖 2B)。在高劑量組中, 不僅有動脈瘤、細胞增生和鰓小片彎曲等病變, 還出現(xiàn)了細胞脫落的現(xiàn)象(圖 2C)。

2.3 Cd2+暴露對鰓抗氧化指標的影響

如圖 3所示, 隨著水體Cd2+濃度的升高, CAT的活性逐漸降低, 而GPx的活性以及H2O2的含量逐漸升高, 且均在高劑量組差異顯著(P＜0.05)。與對照組相比較, 低劑量組和高劑量組GSH的含量均顯著降低, 而GST和AHR的活性顯著升高(P＜0.05)。此外, Cd暴露對SOD的活性無顯著影響(P＞0.05)。

表 1 qPCR引物Tab. 1 Primers used for qPCR

圖 1 Cd2+暴露8周對黃顙魚鰓中Cd含量的影響Fig. 1 Cd accumulation in gill of yellow catfish after 8 week exposure

2.4 Cd2+暴露對鰓免疫相關基因表達水平的影響

如圖 4所示, 與對照組相比較, 腫瘤壞死因子-d(tnf-α)、主要組織相容性復合體(mhc)、白細胞介素-10(il-10)、轉化生長因子-β(tgf-β)和補體因子C3(c3)的表達水平在低劑量組無顯著變化(P＞0.05),而在高劑量組顯著上調(P＜0.05)。此外, 在低劑量組和高劑量組中白細胞介素-1β(il-1β)、白細胞介素-8(il-8)及溶菌酶(lys)的mRNA水平均顯著高于對照組(P＜0.05)。

3 討論

3.1 Cd2+暴露對鰓中Cd含量及組織學的影響

圖 2 Cd2+暴露8周對黃顙魚鰓組織學的影響(×400)Fig. 2 Effects of Cd2+ exposure for 8 weeks on histology of gill of yellow catfish (×400)

圖 3 Cd2+暴露8周對黃顙魚鰓中抗氧化指標的影響Fig. 3 Effects of Cd2+ exposure for 8 weeks on antioxidant-related parameters in gill of yellow catfish

在本研究中, 隨著水體Cd2+濃度的升高, 鰓中Cd含量上升, 反映了鰓對水中Cd的富集效應, 這與在喀拉鲃(Catla catla)[16]和牙鲆(Paralichthys olivaceus)[17]中的研究結果相符。重金屬在水生生物體內的積累通過以下途徑實現(xiàn): 一是鰓不斷吸收水中的重金屬離子, 然后積累在表面細胞中或通過血液輸送到各個部位; 二是通過攝食, 經消化道進入體內; 此外, 體表與水體的滲透交換作用也可能是重金屬進入體內的又一個途徑[18]。因此, Cd在鰓組織的積累可能是以上3個途徑的共同作用, 但鰓直接吸收水中Cd2+可能起主導作用。當重金屬在體內蓄積到一定程度時, 會引起組織學病變。魚鰓組織學是毒理學研究的重要生物指標[19]。在本研究中, Cd暴露損傷了鰓的組織結構, 包括動脈瘤形成、細胞增生、鰓小片彎曲以及細胞脫落等。類似地, Liu等[20]發(fā)現(xiàn), 矛尾復蝦虎(Synechogobiushasta)暴露于0.29 mg/L Cd2+水體15d后鰓出現(xiàn)動脈瘤和細胞增生; Thophon等[21]發(fā)現(xiàn), 尖吻鱸(Lates calcarifer)暴露于20.12 mg/L Cd2+水體48h后鰓出現(xiàn)動脈瘤, 而72h和96h鰓出現(xiàn)細胞增生。這些組織學損傷一方面可能會影響鰓的呼吸功能; 但另一方面, 動脈瘤、細胞增生和鰓小片彎曲等組織學改變也是機體的一種防御機制, 即通過這些改變, 可以增加Cd到達血管的距離, 一定程度上阻止Cd進入細胞[22, 23]。

3.2 Cd2+暴露對鰓抗氧化指標的影響

圖 4 Cd2+暴露8周對黃顙魚鰓中免疫相關基因mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effects of Cd2+ exposure for 8 weeks on the mRNA levels of immune-related genes in gill of yellow catfish

魚類受到重金屬脅迫時, 體內會產生大量活性氧(ROS), 如超氧陰離子(O2-)、羥自由基(·OH)和H2O2等[24]。如果這些ROS不能被及時有效地清除,將導致體內各種大分子如蛋白質、脂類等受到破壞, 造成氧化損傷, 進而影響魚體組織和器官的正常生理功能[25, 26]。在抗氧化系統(tǒng)中, SOD-CAT系統(tǒng)是抵抗ROS的第一道防線[27], 其中, SOD將O2-轉換成而CAT進一步將H2O2轉換成水[29]。因此, 如果SOD活性不變, 而CAT活性降低則可能導致H2O2積累。在本研究中, Cd2+暴露對鰓中SOD活性無顯著影響, 但顯著抑制了CAT的活性, 從而使Cd暴露組中H2O2含量升高。GPx是機體內廣泛存在的一種過氧化物分解酶, 可將有毒的H2O2帶入無毒的羥基化合物(GSSG)中[30], 防止H2O2對細胞膜結構和功能的干擾和破壞。在本研究中, 高劑量組CAT活性降低的同時, GPx活性升高, 這可能是一種補償機制, 表明GPx在鰓清除H2O2方面起關鍵作用。研究表明, 當魚類受到低濃度Cd脅迫時, SOD、CAT和GPx活性均表現(xiàn)為升高, 而當受到高濃度Cd脅迫時, 這些酶的活性則表現(xiàn)為不同程度的降低, 其劑量-效應關系曲線為拋物線[31]。GSH是機體中重要的抗氧化劑和自由基清除劑。GST是一種生物轉化酶, 催化有害物質與GSH的偶聯(lián)反應,從而保護細胞免受氧化損傷[31]。在本研究中, Cd2+暴露導致GST的活性顯著升高, 而GSH的含量顯著降低, 這與Farombi等[32]的研究結果一致。GST活性增強是對鰓中Cd積累的適應性反應, 即鰓通過提升GST活性增加Cd與GSH之間的共軛, 以應對Cd引起的氧化應激[33]。GSH含量的減少表明鰓消耗GSH來清除有毒的代謝廢物。·OH是最活潑也是最具危害性的自由基, 其氧化能力極強, 往往難以清除[34]。AHR活性是評估清除·OH能力的重要指標。在本實驗中, 低濃度組和高濃度組AHR活性均顯著高于對照組, 這進一步證實Cd暴露激活了鰓的抗氧化防御系統(tǒng)。

3.3 Cd2+暴露對鰓免疫相關基因表達水平的影響

魚類的免疫系統(tǒng)在識別和清除外來抗原、抗感染及維持機體內環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮著至關重要的作用[35]。有研究表明, Cd暴露可引起魚體先天性免疫和特異性免疫[36]。Cd影響先天性免疫功能主要表現(xiàn)在改變魚體免疫相關酶活性、血液白細胞吞噬能力、補體溶血活性及血細胞呼吸爆發(fā)活性等[37, 38]。在特異性免疫方面, Cd暴露可導致魚體血清總免疫球蛋白M含量顯著升高[38]。此外, Cd對淋巴細胞有直接作用, 可抑制T、B細胞增殖和B細胞釋放抗體, 也可抑制淋巴細胞DNA合成以及細胞膜上的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性,進而影響淋巴細胞的轉化[6, 39]。在脊椎動物中, 免疫反應通常以炎癥反應為特征[40]。在動物發(fā)生炎癥時, TNF-α通常最先被釋放[41]。TNF-α是促炎癥細胞因子, 由免疫細胞釋放, 與機體的各種炎癥、感染和疾病密切相關[42]。MHC家族編碼而成的分子位于細胞表面, 其主要功能是結合由病原體衍生的肽鏈, 從而在細胞表面顯示出該病原體, 以便T細胞識別并執(zhí)行一系列免疫功能[43]。已有研究表明mhc可被tnf-α調節(jié)[44]。在本研究中, Cd暴露上調了鰓中tnf-α和mhc表達水平, 表明Cd暴露誘導了鰓的免疫反應。白細胞介素(IL)是由淋巴細胞、單核細胞等產生的細胞因子, 在免疫調節(jié)、造血以及炎癥過程中起著調節(jié)作用[45]。在本研究中, 與對照組相比, Cd暴露組鰓中il-1β和il-8的轉錄水平明顯下調,而il-10的表達水平顯著上調。促炎細胞因子il-1β和il-8的下調一方面可能是Cd誘導的免疫抑制效應, 另一方面也可能跟抗炎細胞因子il-10表達水平上調有關。TGF-β是抗炎和免疫抑制細胞因子, 參與細胞的生長、分化和免疫功能[46]。因此, 在本研究中tgf-β的上調可能是黃顙魚免疫系統(tǒng)為修復Cd暴露所導致的鰓損傷的一種平衡機制。溶菌酶(LYS)是魚類先天性免疫的重要組成部分, 由多種白細胞產生, 包括中性粒細胞和巨噬細胞[47]。已有研究表明, LYS與機體防御機制有關, 如抗病毒、溶菌、免疫應答等[48]。在本研究中, Cd暴露黃顙魚8周后, 下調了鰓中l(wèi)ys的表達水平, 表明Cd暴露可能抑制了鰓的抗菌能力, 干擾黃顙魚的先天性免疫系統(tǒng), 反映了Cd對黃顙魚的免疫毒性。此外, 補體在魚類宿主防御方面起著關鍵作用, 啟動后可參與機體靶細胞溶解[49]。在補體系統(tǒng)中, 補體因子C3是主要成分, 其在免疫防御、免疫調節(jié)和免疫病理中起著重要作用[49]。在本研究中, 高劑量組c3的表達水平顯著上調, 表明補體系統(tǒng)被激活以抵御Cd暴露誘導的鰓損傷。

綜上所述, 本研究表明, 黃顙魚暴露于50和200 μg/L Cd2+的水體8周后, 其鰓中Cd積累, 并誘導鰓的組織學損傷、氧化應激和免疫反應。同時, 抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)在Cd誘導的鰓損傷中發(fā)揮了重要的保護作用。