卞光明 王娜泠 胡則輝 王躍斌 胡成碩 柴學軍

(1. 浙江省海洋水產(chǎn)研究所, 浙江海洋大學海洋與漁業(yè)研究所, 浙江省海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 舟山 316021;2. 江蘇省射陽縣長蕩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 鹽城 224322)

帶魚(Trichiurus lepturus)隸屬鱸形目(Perciformes), 帶魚科(Trichiuridae), 帶魚屬(Trichiurus),是東海區(qū)最重要的漁獲對象, 其捕撈產(chǎn)量居于經(jīng)濟魚類產(chǎn)量之首。由于捕撈強度日益增大以及環(huán)境因子變化, 東海帶魚資源面臨巨大壓力, 出現(xiàn)漁獲質(zhì)量較差、群體組成小型化、性成熟提前以及年齡結(jié)構(gòu)失衡等現(xiàn)象, 開展帶魚種質(zhì)資源研究工作刻不容緩。

帶魚種群的適應(yīng)能力、生存能力以及進化潛力都與其遺傳多樣性有關(guān)聯(lián), 所以群體遺傳多樣性分析是開展種質(zhì)資源保護工作的前提和基礎(chǔ)。線粒體DNA分子量小、進化速度快, 突變形成的多態(tài)位點可反映出群體遺傳特征、種群分化等特點, 是研究群體分化以及種質(zhì)資源評估的理想手段[1]。線粒體COⅠ基因進化速率快, 包含遺傳進化信息量大, 16S rRNA基因結(jié)構(gòu)序列較為保守, 可以簡便地使用通用引物進行PCR擴增, 因此,COⅠ與16S rRNA基因在生物群體遺傳學中應(yīng)用廣泛[2—7]。

目前東海帶魚的研究主要集中在攝食[8]、資源評估模型應(yīng)用[9]、繁殖[10]、資源動態(tài)[11]等方面, 關(guān)于東海帶魚分子標記群體分析, 僅見鄭文娟等[12]基于線粒體控制區(qū)分析3個舟山海域帶魚群體多樣性。本文基于線粒體COⅠ和16S rRNA基因?qū)|海海域3個帶魚群體進行比較分析遺傳距離, 構(gòu)建分子系統(tǒng)樹, 探討東海帶魚不同群體基因交流情況,以期從線粒體水平上了解東海帶魚資源的遺傳背景, 為帶魚資源的合理開發(fā)提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用的東海帶魚樣品由雙拖船取自中國東海海域不同的3個群體, 現(xiàn)場取其背部肌肉置于酒精中保存, 并編號A、B、C, 每群體樣本數(shù)、采集地點、采集時間分別為群體A (19、122°32′E 29°55′N、2015年10月)、群體B (34、123°30′E 26°75′N、2016年4月)、群體C (19、124°24′E 27°26′N、2016年4月)置于超低溫冰箱(-70℃)保存?zhèn)溆? 具體采樣情況見圖 1(坐標系為WGS84)。

1.2 實驗方法

基因組DNA的提取采用TIANamp Marine Animals DNA Kit試劑盒推薦的方法提取帶魚基因組總DNA, 通過0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性, 并用Nanodrop 2000測DNA的質(zhì)量與濃度, 置于-20℃保存。

線粒體COⅠ基因擴增及測序從GenBank中下載帶魚線粒體COⅠ基因序列[13], 運用Oligo7軟件[14]設(shè)計COⅠ基因PCR擴增引物:COⅠ-F: 5′-CGTGGCAATTACCCGTTGATTCTTCT-3′和COⅠ-R: 5′-GACTGCACTAAGACAAAGGCTGG TT-3′(上海生工合成), 目的基因片段大小約1500 bp。PCR擴增體系為25 μL, 包含2×TaqMasterMix(康維世紀)12.5 μL, 模板DNA 100 ng, 10 μmol/L的引物各1 μL, ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5min; 94℃變性1min、50℃退火90s、72℃延伸45s, 共35個循環(huán); 最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證條帶的大小后, 送往上海杰李生物技術(shù)公司進行純化和雙向測序。

線粒體16S rRNA片段擴增及測序所用引物序列[15]為16S-F:5′-GCCTGTTTATCAAAAAC AT-3′和16S-R:5′-CCGGTCTGAACTCAGATCA CGT-3′(上海生工合成), 目的片段大小約600 bp。PCR反應(yīng)總體積為25 μL, 含有模板DNA 100 ng,0.5 μL上、下游引物(10 μmol/L), 最后補充去離子水至25 μL, 反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性2min, 然后進行35個循環(huán), 每個循環(huán)包括94℃ 45s, 50℃ 1min,72℃ 1min, 在最后一個循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后委托上海杰李生物公司進行正向測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用ContigExpress Project[16]對測序結(jié)果進行拼接, 然后使用BioEdit[17]對所得序列進行編輯及人工核查。利用DnaSP 5.0軟件[18]計算群體的單倍型(H)、核苷酸多態(tài)位點數(shù)(S)、平均核苷酸多態(tài)性(K)、核苷酸多樣性指數(shù)(π)、遺傳分化系數(shù)(Gst)與固定系數(shù)(Fst), 進行Tajima中性檢驗[19]。用MEGA 5.0軟件[20]分析序列堿基組成, 并使用Kimura two-Parameter模型計算帶魚群體間的遺傳距離, 利用鄰接法(Neighbor-Jioning, NJ)構(gòu)建個體間的分子發(fā)育進化樹, 并采用Bootstrap 1000檢驗系統(tǒng)樹各分支的置信度。

圖 1 采樣點地理位置Fig. 1 Locations of the sampling stations

2 結(jié)果

2.1 線粒體COⅠ和16S rRNA基因片段序列特征分析

測序得到的目的片段經(jīng)BioEdit比對及人工校正去除序列端部不穩(wěn)定部分, 并通過BLAST分析比較, 確認得到1130 bp的COⅠ基因片段和554 bp的16S rRNA基因片段。通過MEGA 5.0軟件計算72個帶魚樣品的COⅠ和16S rRNA序列的堿基組成,COⅠ基因序列堿基T、C、A、G和A+T的平均含量分別為29.0%、28.9%、24.4%、17.7%和53.4%;16S rRNA基因序列的堿基T、C、A、G和A+T的平均含量分別為22.7%、27.6%、28.0%、21.7%和50.7%, A+T含量均略高于C+G, 符合硬骨魚類線粒體DNACOⅠ和16S rRNA基因片段的堿基組成特征。

16S rRNA基因片段共檢測到8種單倍型(Hap 1—Hap 8), 8個多態(tài)位點, 約占總序列的1.44%, 包括5個單一變異位點和3個簡約信息位點(表 1)。其中, 轉(zhuǎn)換位點7個, 包含1個A/G轉(zhuǎn)換, 位于241位點;6個C/T轉(zhuǎn)換, 分別位于169、170、232、256、326以及329位點。1個A/T顛換, 位于320位點, 轉(zhuǎn)換/顛換率R為7。群體A、群體B、群體C共用3個單倍型, 其余單倍型均為每個群體獨享, 單倍型1在群體中分布頻率為79% (72個個體)。COⅠ基因序列檢測到43種單倍型, 多態(tài)位點49個, 約占總序列的4.34%, 包括20個單一變異位點和簡約信息位點29個(表 2)。其中, 轉(zhuǎn)換位點42個, 顛換位點7個, 無插入/缺失位點, 轉(zhuǎn)換/顛換率R為6。

2.2 群體遺傳多樣性分析

本實驗將16S rRNA基因片段和COⅠ基因片段合并為一條總長度為1684 bp (不包括插入/缺失)的片段, 以用于群體遺傳多樣性分析。通過DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計帶魚群體16S rRNA、COⅠ和聯(lián)合基因序列遺傳多樣性參數(shù)(表 3)。

基于COⅠ基因片段, 群體A單倍型多樣性(Hd)最高(0.9983), 群體B與群體C的單倍型多樣性相近。群體A的平均核苷酸差異數(shù)(K)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)在3個群體中均最高, 分別為7.111和0.0063, 其次為群體C (5.766和0.0051)、群體B(5.111和0.0045)?；?6S rRNA基因片段, 群體A的單倍型多樣性(Hd)最高為0.4678, 群體B、群體C相近。群體A平均核苷酸差異數(shù)(K)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.632和0.0011, 在3個群體中均處于最高值, 群體C(0.596和0.0011)、群體B(0.512和0.0009)次之。根據(jù)16S rRNA和COⅠ聯(lián)合基因片段, 群體A單倍型多樣性(Hd)最高(0.9992), 群體B與群體C的單倍型多樣性接近。群體A的平均核苷酸差異數(shù)(K)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)在3個群體中均最高, 分別為9.014和0.0076, 其次為群體C (7.021和0.0066)、群體B (6.732和0.0058)。根據(jù)各遺傳多樣性參數(shù)比較3個群體, 線粒體單基因和聯(lián)合基因片段得出的結(jié)果一致。

2.3 遺傳分化分析

群體內(nèi)遺傳分化基于帶魚COⅠ和16S rRNA基因序列, 用MEGA 5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹(圖 2、圖 3),拓撲圖顯示, 同一群體內(nèi)大部分個體首先聚在一起,存在不同群體間帶魚個體聚合, 這個現(xiàn)象與帶魚群體內(nèi)和群體間的遺傳距離差異較小以及群體間的遺傳分化系數(shù)較低相一致。

群體間遺傳分化基于COⅠ基因序列片段,3個群體間, 群體A與群體C遺傳距離最大(0.0061),群體B與群體C種間遺傳距離最小(0.0048), 這與群體地理位置遠近相符合, 群體A遺傳距離最大, 其次為群體B、群體C, 分別為0.0063、0.0051和0.0046(表 4)。基于16S rRNA和聯(lián)合16S rRNA和COⅠ基因的遺傳距離比較情況與線粒體DNACOⅠ基因一致。

表 1 帶魚單倍型16S rRNA基因序列片段及變異位點分布Tab. 1 Variable sites of 16S rRNA gene sequence from different haplotypes of T. lepturus

根據(jù)3個群體間遺傳距離, 以南海帶魚[21]為外群, 構(gòu)建群體間的UPGMA系統(tǒng)樹, 據(jù)圖 4、圖 5顯示, 基于COⅠ基因序列, 群體B與群體C首先聚成一支, 接著與群體A聚類, 南海帶魚群體獨立為一支?；?6S rRNA基因序列聚類情況與COⅠ基因類似, 但群體A與群體B和群體C的分化程度低, 3個群體幾乎聚在一起, 南海帶魚群體獨立為一支。

通過DNAsp 5.0軟件統(tǒng)計結(jié)果顯示,COⅠ基因片段和16S rRNA基因片段的總?cè)后w遺傳分化系數(shù)(Gst)為-0.00183和-0.01899, 群體總固定系數(shù)(Fst)為0.04014和-0.02676, 基因流(Nm)為5.98和-9.59。如表 5所示, 基于COⅠ基因片段, 3個群體間的遺傳分化系數(shù)(Gst)在-0.00787—0.00471, 平均為-0.00043;固定系數(shù)(Fst)范圍-0.00750—0.06544, 均值為0.03718; 總?cè)后w的Tajima’sD檢測為負值, 不顯著(P＞0.10); 基于16S rRNA基因片段, 遺傳分化系數(shù)(Gst)、固定系數(shù)(Fst)的范圍分別-0.01672—(-0.1032)、-0.03144—(-0.02283), 均值分別為-0.01399、-0.02683; 總?cè)后w的Tajima’sD檢測為負值, 不顯著(0.10＞P＞0.05)。

表 2 帶魚單倍型COⅠ基因序列片段及變異位點分布Tab. 2 Variable sites of COⅠ gene sequence from different haplotypes of T. lepturus

表 3 帶魚不同群體內(nèi)線粒體DNA單倍型多樣度Tab. 3 Haplotype diversity (H) of mtDNA in three populations of T. lepturus

圖 2 基于COⅠ基因片段的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 2 The construction of phylogenetic trees based on Neighbour-Joining (NJ) method for T. lepturus

3 討論

3.1 線粒體COⅠ和16S rRNA基因片段序列比較分析

圖 3 基于16S rRNA基因片段的NJ系統(tǒng)進化樹Fig. 3 NJ phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of T. lepturus

堿基組成分析表明, 帶魚COⅠ和16S rRNA基因片段的A+T含量均微高于G+C含量, 符合硬骨魚相應(yīng)序列特征, 與蒙子寧[22]、李鵬飛等[23]、肖永雙[24]研究結(jié)果基本一致。本研究的帶魚群體COⅠ基因序列共檢測出49個變異位點, 占比對位點的4.34%,變異程度高于16S rRNA基因序列檢測到的8個變異位點(1.44%), 這多是由于海洋動物線粒體DNA不同區(qū)域核苷酸的突變速率或不同基因片段的選擇壓力不同, 使得線粒體不同片段的核苷酸序列存在差異[25]。

3.2 遺傳多樣性分析

3個帶魚群體的COⅠ和16S rRNA基因片段的單倍型多樣性(Hd)、平均核苷酸差異數(shù)(K)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.97692和0.38772、5.96088和0.55595、0.00528和0.00101。蒙子寧[22]基于線粒體DNA 16S rRNA標記(500 bp)對黃海帶魚(n=12)多樣性檢測分析, 結(jié)果顯示, 只檢測到3個單倍型,遺傳距離(D)為0.001, 單倍型多樣性指數(shù)(Hd)為0.25, 核苷酸多樣性指數(shù)(π)是0.00068; 李鵬飛等[23]對浙江近海水域帶魚群體(n=15)線粒體COⅠ基因序列(609 bp)變異分析, 發(fā)現(xiàn)15個序列中有10個單倍型, 轉(zhuǎn)換/顛換率為5.5, 核苷酸多樣性指數(shù)(π)為0.00513。本實驗對比于蒙子寧[22]、李鵬飛等[23]所得的遺傳距離以及核苷酸多樣性指數(shù)相差無幾, 平均核苷酸多樣性差異略高, 推測可能由于兩研究的試驗樣品數(shù)量不多。肖永雙[24]對帶魚3個地理群體[南海(n=20)、溫州(n=20)、北海(n=14)]的D-loop區(qū)序列(556 bp)測序分析, 在54個個體中檢測到40個單倍型, 單倍型多樣性指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別為0.98±0.01和0.008±0.005; 鄭文娟等[12]研究舟山海域帶魚(n=54)線粒體DNA D-loop區(qū)序列(527 bp), 共檢測到44個單倍型, 單倍型多樣性指數(shù)(Hd)是0.991, 核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)為0.012。肖永雙[24]、鄭文娟等[12]得出的群體單倍型指數(shù)(Hd)和核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)均明顯高于本實驗, 主要是由于線粒體D-loop區(qū)進化速率高于線粒體DNACOⅠ基因序列和16S rRNA基因序列。

如表 6所示, 與中國近海其他常見魚類相比, 基于COⅠ基因東海帶魚群體單倍型多樣性以及核苷酸算多樣性水平較高。鑒于一般海洋魚類線粒體遺傳信息單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)分別處于0.11—1.00、0.0008—0.0320[32], 基于16S rRNA基因分析, 東海帶魚群體屬于低單倍型、低核苷酸多樣性(Hd＜0.5,Pi＜0.005), 基于COⅠ基因帶魚群體單倍型較高, 核苷酸多樣性仍較低, 綜合單倍型多樣性(Hd)、平均遺傳距離(D)、群體遺傳多樣性指數(shù)(Pi)等參數(shù), 基于線粒體COⅠ和16S rRNA基因發(fā)現(xiàn)東海帶魚遺傳多樣性水平不高。

表 4 帶魚群體間和群體內(nèi)平均遺傳距離Tab. 4 Genetic distances among and within populations of T. lepturus

圖 4 基于COⅠ基因序列帶魚群體間UPMGA系統(tǒng)樹Fig. 4 Construction of a distance tree with the Unweighted Pair Group Method with Arithmatic Mean (UPGMA) among populations of T. lepturus based on COⅠ gene sequences

圖 5 基于16S rRNA基因序列帶魚群體間UPMGA系統(tǒng)樹Fig. 5 UPMGA phylogenetic tree among populations of T.lepturus based on 16S rRNA sequences

表 5 帶魚群體遺傳分化系數(shù)Gst (上三角)與固定系數(shù)Fst (下三角)Tab. 5 Gst values (above the diagonal) and Fst values (below the diagonal) among populations of T. lepturus

表 6 海洋魚類COⅠ基因遺傳多樣性Tab. 6 The genetic diversity of marine fish in COⅠ gene

3.3 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

鑒于Shaklee等[33]提出的魚類在屬、種和種群三級水平上遺傳距離分別是0.9、0.30和0.05的分類依據(jù), 3個帶魚群體間均未達到種群的分化標準。3個帶魚群體與南海帶魚的COⅠ和16S rRNA基因序列的遺傳距離分別0.11412和0.04907, 結(jié)果顯示COⅠ基因能夠較好區(qū)分東海帶魚和南海帶魚, 而線粒體16S rRNA基因序列標記則未能區(qū)分。

基于COⅠ基因片段, 群體B與群體C之間的遺傳分化系數(shù)(Fst)出現(xiàn)負值, 說明群體B與群體C內(nèi)部差異大于群體間差異, 群體B與群體C之間未發(fā)生遺傳分化, 推測可能由于2個群體是隨機交配的群體, 群體B雖處于閩東漁場, 但距離群體C(溫臺漁場)較近, 且群體B與群體C均處于東海帶魚索餌場與越冬場重疊區(qū)內(nèi)[34], 兩群體間交流較為頻繁造成?；?6S rRNA基因片段, 群體間的遺傳分化系數(shù)均為負值, 推測可能由于3個帶魚群體的線粒體16S rRNA基因序列較為保守、變異率低, 群體間分化程度較低導致。鄭文娟等[12]、肖永雙[24]分析帶魚群體線粒體控制區(qū)遺傳多樣性也得到群體間遺傳分化系數(shù)為負值的結(jié)果?；?個基因片段各群體遺傳參數(shù)比較, 群體A在3個群體中遺傳學背景最為豐富, 群體B遺傳最穩(wěn)定, 主要原因可能是群體A處于舟山漁場, 距離東海中部外側(cè)中心越冬場較近, 且每年春季, 東海南部越冬帶魚群體向東北方向洄游至舟山漁場產(chǎn)卵, 是不同帶魚群體的交匯區(qū)域。帶魚分布廣泛、長距離遷移能力強, 產(chǎn)卵、索餌、越冬均產(chǎn)生洄游, 一定程度上會縮小了群體間的差異。此外, 東海帶魚屬于多次性產(chǎn)卵類型、魚卵具有漂浮型, 產(chǎn)卵期間可排卵2—3次, 一般第1次與第2次排卵時間間隔約1個月[35], 這為帶魚群體間基因交流提供了時間和空間上的便利, 造成群體間遺傳分化程度不顯著。

東海帶魚漁獲量一直位于我國海洋捕撈魚類首位, 因帶魚資源被過度開發(fā), 產(chǎn)量急劇下降。隨著執(zhí)行伏季休漁制度、啟動東海帶魚國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)、開展“一打三整治”工作、引進TAC及ITQ制度等一系列措施的實施, 東海帶魚產(chǎn)量逐漸穩(wěn)定在年產(chǎn)8×108kg, 但根據(jù)東海區(qū)漁業(yè)資源動態(tài)監(jiān)控網(wǎng)浙江站近年(2012—2015年)漁業(yè)資源動態(tài)調(diào)查監(jiān)控資料來看[36], 東海帶魚資源量波動劇烈, 遠未恢復(fù)到常年水平。故而, 在今后帶魚的資源管理和利用中, 繼續(xù)以保護帶魚群體的遺傳資源為中心, 合理控制捕撈力度, 避免人為基因滲透導致帶魚群體遺傳多樣性的丟失, 實現(xiàn)帶魚種質(zhì)資源的可持續(xù)利用。除此之外, 采用其他分子技術(shù)或選擇DNA其他基因區(qū)域獲取多組序列數(shù)據(jù)進行全面評估東海帶魚群體的遺傳多樣性水平以及開展人工繁育等研究對于帶魚資源的持續(xù)利用也尤為重要。