周宇芳，胡建坤，郝云彬，相興偉，楊會(huì)成，鄭 斌,*，肖金星

（1.浙江省海洋開(kāi)發(fā)研究院，浙江 舟山 316100；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；3.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316100）

我國(guó)是蝦類養(yǎng)殖與捕撈大國(guó)，總產(chǎn)量位列全球首位，其中海水蝦占比56%以上，是我國(guó)大宗出口水產(chǎn)品之一[1-2]。海水蝦味美肉嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞，在我國(guó)水產(chǎn)食品中占有支柱地位。由于體內(nèi)水分、蛋白質(zhì)等含量高，蝦類在捕撈、運(yùn)輸、加工及貯藏過(guò)程中容易腐敗變質(zhì)，尤其是極易發(fā)生黑變[3]。海水蝦黑變的發(fā)生是由于表面酪氨酸或其衍生物等色原物質(zhì)在多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）的作用下經(jīng)過(guò)一系列生化反應(yīng)最終產(chǎn)生黑色素[4]，嚴(yán)重影響產(chǎn)品感官品質(zhì)，制約其商品價(jià)值。因此，保持蝦的色澤和鮮度成為海水蝦產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵技術(shù)，保鮮防黑變技術(shù)的研發(fā)對(duì)于保證原料品質(zhì)、避免經(jīng)濟(jì)損失意義重大。

目前，我國(guó)普遍采用二氧化硫產(chǎn)生物（亞硫酸鹽），其能將黑色素形成過(guò)程的中間產(chǎn)物醌還原成無(wú)色化合物（雙酚），從而有效防止蝦類黑變[5]。但是，亞硫酸鹽添加到食品中存在嚴(yán)重的安全性問(wèn)題，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織以及美國(guó)、日本、歐盟等國(guó)家都嚴(yán)格規(guī)定蝦肉中SO2殘留不得超過(guò)0.1 mg/g[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在蝦類防黑變生物保鮮劑的開(kāi)發(fā)方面進(jìn)行了部分研究，但是主要集中在中華管鞭蝦（Solenocera crassicornis）等不同品種蝦類PPO的制備與生化特征分析[7-9]、不同抑制因子效果評(píng)價(jià)[10-12]及復(fù)合抑制劑產(chǎn)品開(kāi)發(fā)[13-14]等方面，缺乏對(duì)抑制功效成分作用機(jī)理的系統(tǒng)研究。分子動(dòng)力學(xué)模擬是一種在原子水平上理解分子運(yùn)動(dòng)細(xì)節(jié)的方法[15]，可以直觀給出反應(yīng)體系在一定溫度條件下的結(jié)構(gòu)變化等，是研究酶催化機(jī)理的有效方法[16]。因此，可應(yīng)用分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)推斷抑制因子對(duì)PPO的抑制機(jī)理。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)團(tuán)隊(duì)前期開(kāi)發(fā)的海水蝦無(wú)硫復(fù)合抑制劑主要功效成分4-己基間苯二酚（4-hexylresorcinol，4-HR）與抗壞血酸，開(kāi)展2 種抑制因子的抑制效果及抑制類型研究，同時(shí)從抑制因子化學(xué)結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)模型出發(fā)分析推斷其抑制機(jī)理，為綠色、高效的海水蝦防黑變產(chǎn)品的應(yīng)用推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮中華管鞭蝦購(gòu)自舟山國(guó)際水產(chǎn)城碼頭，加冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，－80 ℃超低溫暫存。

L-抗壞血酸（食品級(jí)），4-HR、3-（3,4-二羥基苯基）-L-丙氨酸（3,4-dihydroxyphenyl-L-alanine，L-DOPA）（均為分析純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；丙酮、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無(wú)水硫酸銨（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA T10組織勻漿機(jī) 艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；UV2300紫外-可見(jiàn)分光光度儀 上海天美科學(xué)儀器有限公司；CT14RD冷凍離心機(jī) 上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電氣有限公司；DHG-9076A恒溫干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BSA224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；FE28-Stan pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 海水蝦PPO的制備

采用Xiang Xingwei等[7]的方法，進(jìn)行PPO的制備。

1.3.2 PPO活力的測(cè)定

參照Nirmal等[17]的方法并略有改進(jìn)。以L-DOPA為特異性底物，將1 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）與1.2 mL 15 mmol/L L-DOPA混合均勻，45 ℃預(yù)熱3 min，然后加入45 ℃預(yù)熱3 min的待測(cè)酶液200 μL，混勻后立即在波長(zhǎng)475 nm處測(cè)定吸光度變化，測(cè)定6 min，每1 min吸光度增加0.001定義為1 個(gè)酶活力單位。

1.3.3 抑制因子對(duì)PPO酶促反應(yīng)的影響

反應(yīng)體系中依次加入45 ℃預(yù)熱過(guò)的1.2 mL 15 mmol/L L-DOPA、1 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）、100 μL不同濃度的抑制因子和200 μL酶液，2 種抑制因子在反應(yīng)體系中的終濃度如下：4-HR分別為0.01、0.03、0.05、0.10 mmol/L，抗壞血酸分別為0.5、1.0、2.0、2.5 mmol/L，酶活力測(cè)定方法同1.3.2節(jié)，空白對(duì)照組以100 μL超純水代替抑制因子。酶被抑制因子處理前后酶活力變化以剩余酶活力表示。酶促反應(yīng)體系達(dá)到穩(wěn)定態(tài)后，吸光度隨時(shí)間延長(zhǎng)的線性段直線外推得到的橫截距為遲滯時(shí)間。

1.3.4 抑制因子對(duì)PPO的抑制類型和抑制常數(shù)

以L-DOPA為底物，在不同底物濃度條件下，測(cè)定不同濃度的4-HR與抗壞血酸的PPO活力抑制效果。通過(guò)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，以底物濃度的倒數(shù)為X軸，反應(yīng)速率的倒數(shù)為Y軸，判斷不同抑制劑的抑制類型。抑制常數(shù)的測(cè)定是通過(guò)直線的斜率和縱軸截距對(duì)抑制劑濃度二次作圖，得到抑制劑對(duì)游離酶的抑制常數(shù)（KI）。

1.3.5 2 種抑制因子作用過(guò)程的化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬分析

采用ChemBioOffice Ultra軟件，利用分子動(dòng)力學(xué)模型MM2力場(chǎng)，基于量子化學(xué)的分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算方法對(duì)酶抑制反應(yīng)路徑進(jìn)行多次模擬優(yōu)化，利用密度泛函理論計(jì)算各反應(yīng)路徑中穩(wěn)態(tài)和過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)和能量，并對(duì)分子模擬結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證[18-21]。通過(guò)以上分子動(dòng)力學(xué)模擬分析，預(yù)測(cè)各抑制動(dòng)力學(xué)流程及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)變化特征，探討2 種抑制因子的抑制機(jī)理。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Excel 2007軟件繪圖。采用ChemBioOffice Ultra軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算，并繪制反應(yīng)流程圖及結(jié)構(gòu)變化示意圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種抑制因子對(duì)中華管鞭蝦PPO酶促反應(yīng)的影響

圖1 4-HR（A）和抗壞血酸（B）對(duì)中華管鞭蝦PPO活力和遲滯時(shí)間的影響Fig. 1 Effects of 4-HR (A) and ascorbic acid (B) on the relative activity and the lag time of PPO

由圖1A可知，4-HR對(duì)PPO活力有明顯的抑制作用。隨著4-HR濃度的增加，PPO的剩余酶活力逐漸降低，半抑制濃度為0.072 mmol/L。同時(shí)，4-HR使PPO酶促反應(yīng)的發(fā)生產(chǎn)生一定的延滯，遲滯時(shí)間隨4-HR濃度的增加而顯著延長(zhǎng)（P＜0.05）。4-HR對(duì)PPO的延滯可能是4-HR與底物競(jìng)爭(zhēng)性地與酶結(jié)合，產(chǎn)生無(wú)色物質(zhì)，阻止黑變的發(fā)生。由圖1B可以看出，抗壞血酸對(duì)PPO的抑制作用明顯，其抑制作用及遲滯時(shí)間隨抗壞血酸濃度的增加而增大（P＜0.05），半抑制濃度為2.02 mmol/L，遠(yuǎn)高于4-HR，說(shuō)明4-HR對(duì)中華管鞭蝦PPO的抑制作用能力更強(qiáng)，與Leekim等[22]研究結(jié)果一致。

2.2 2 種抑制因子對(duì)海水蝦PPO的抑制類型

圖2 不同濃度4-HR（A）和抗壞血酸（B）處理的中華管鞭蝦PPO的Lineweaver-Burk圖Fig. 2 Lineweaver-Burk plots for PPO in the presence of different concentrations of 4-HR (A) and ascorbic acid (B)

圖2 為1 組縱軸截距不變的直線，說(shuō)明4-HR與抗壞血酸不改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率（Vmax），只影響米氏常數(shù)（Km），Km隨著抑制劑濃度的增加而增大，表明4-HR、抗壞血酸對(duì)中華管鞭蝦PPO的抑制作用均為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，說(shuō)明2 種抑制因子同底物競(jìng)爭(zhēng)性地與酶結(jié)合。

大多數(shù)PPO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與底物在結(jié)構(gòu)上有一定的相似性[23]。4-HR是間苯二酚的衍生物，結(jié)構(gòu)與PPO底物鄰苯二酚相近。在底物存在的情況下，4-HR苯環(huán)上羥基與氧化態(tài)酶的活性中心部位競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合[24]，從而減少酶與底物的接觸濃度，降低其催化效率，抑制黑變的發(fā)生。這與Alvarez-Parrilla[25]和Galv?o[26]等研究4-HR黑變抑制作用結(jié)果一致。以不同抑制劑條件下測(cè)定的Km對(duì)抑制劑濃度作圖，從直線斜率可求得4-HR對(duì)PPO的抑制常數(shù)KI為0.022 mmol/L。

關(guān)于抗壞血酸的抑制作用目前有2 種推測(cè)，一般認(rèn)為它們是通過(guò)將PPO氧化中間產(chǎn)物鄰苯醌還原為鄰苯二酸和脫氫抗壞血酸以阻止黑色素生成[27-29]；Ali[30]和Arias[31]等研究認(rèn)為，抗壞血酸除了能直接還原醌類化合物，其也可以通過(guò)與PPO活力中心結(jié)合，直接對(duì)PPO產(chǎn)生抑制作用，圖2B實(shí)驗(yàn)結(jié)果也佐證了這一觀點(diǎn)。不同抑制劑條件下測(cè)定的Km對(duì)抑制劑濃度作圖，從直線斜率可求得抗壞血酸對(duì)中華管鞭蝦PPO的抑制常數(shù)KI為1.388 mmol/L。

2.3 2 種抑制因子作用過(guò)程的化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬分析

2.3.1 4-HR抑制反應(yīng)的模擬分析

圖3 4-HR抑制PPO動(dòng)力學(xué)模型流程圖Fig. 3 Schematic illustration of PPO inhibition by 4-HR

PPO是多亞基的含銅金屬酶，每個(gè)亞基含2 個(gè)金屬銅離子，2 個(gè)金屬銅離子分別與蛋白質(zhì)分子中2 個(gè)平展的組氨酸和1 個(gè)弱的直立組氨酸配體結(jié)合，另有1 個(gè)內(nèi)源橋基將2 個(gè)銅離子聯(lián)系在一起，構(gòu)成PPO催化氧化反應(yīng)活性中心[32]（圖3中還原態(tài)酶）。4-HR是間苯二酚的衍生物，采用MM2力場(chǎng)模擬關(guān)鍵結(jié)合部位分子-原子之間的動(dòng)力學(xué)關(guān)系，預(yù)測(cè)4-HR與PPO的抑制反應(yīng)流程如圖3所示。經(jīng)計(jì)算，中間產(chǎn)物1、2、3、4和5的結(jié)合能分別為445、463、122、127 kcal/mol和1 003 kcal/mol，化合物3和化合物4的能量急劇降低，化學(xué)反應(yīng)更易發(fā)生，誘導(dǎo)反應(yīng)向抑制方向發(fā)展，而化合物5能量極高，不能分解再次得到初始產(chǎn)物脫氧態(tài)酶。

根據(jù)4-HR抑制過(guò)程的分子結(jié)構(gòu)化學(xué)動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果，推測(cè)4-HR的抑制機(jī)理為：酚還原態(tài)酶（銅離子態(tài)）在氧氣的作用下，以過(guò)氧鍵結(jié)合并聯(lián)結(jié)2 個(gè)銅離子形成配位鍵占據(jù)銅離子的2 個(gè)赤道面位置，并作為銅離子之間的橋聯(lián)配體，形成酚氧化態(tài)酶（化合物1），構(gòu)型由平面四邊形轉(zhuǎn)變?yōu)槿请p錐型，如圖4所示。4-HR苯環(huán)間位羥基上的氧原子作為親核試劑進(jìn)攻酚氧化態(tài)酶上的銅離子，絡(luò)合成四角雙錐型構(gòu)型的配位體（化合物2）。因四角雙錐結(jié)構(gòu)的存在，氧氧鍵受σ*受體作用而帶有較少的負(fù)電荷，而π電子受體與氧氧鍵的σ*軌道上的電子作用，削弱了氧氧鍵，氧原子發(fā)生遷移，導(dǎo)致四角雙錐結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的三角雙錐型結(jié)構(gòu)（化合物3）。在酸性條件下，化合物3脫去鄰苯三酚形成具有平面四邊形結(jié)構(gòu)化合物4。因化合物5結(jié)合能很高（1 003 kcal/mol），形成后體系很穩(wěn)定，故化合物4與4-HR結(jié)合進(jìn)入一條幾乎死循環(huán)途徑，不參與正常產(chǎn)物的生成，破壞了PPO的循環(huán)催化路徑，阻止了PPO與底物的結(jié)合，降低其催化效率，抑制黑變發(fā)生。

圖4 4-HR催化體系結(jié)構(gòu)變化示意圖Fig. 4 Schematic diagram of the structural changes of 4-HR-inhibited catalytic system

2.3.2 抗壞血酸抑制反應(yīng)的模擬分析

圖5 抗壞血酸抑制PPO動(dòng)力學(xué)模型流程圖Fig. 5 Schematic illustration of PPO inhibition by ascorbic acid

抗壞血酸分子結(jié)構(gòu)中存在4 個(gè)羥基，分別是芳環(huán)上2 個(gè)羥基，內(nèi)側(cè)支鏈上1 個(gè)羥基，外側(cè)支鏈上2 個(gè)羥基。假設(shè)4 個(gè)羥基分別與PPO活力中心絡(luò)合，根據(jù)分子力場(chǎng)軌道理論，采用薛定諤方程對(duì)穩(wěn)態(tài)的最小能量進(jìn)行計(jì)算，預(yù)測(cè)其抑制機(jī)理如圖5所示。芳環(huán)上2 個(gè)羥基與活性中心結(jié)合的最小靜態(tài)穩(wěn)定能量分別為461 kcal/mol和463 kcal/mol，內(nèi)側(cè)支鏈上羥基與活性中心絡(luò)合的能量為1 116 kcal/mol，外側(cè)支鏈上羥基與活性中心絡(luò)合的最小靜態(tài)穩(wěn)定能量為473 kcal/mol，這表明，內(nèi)側(cè)上羥基空間位與活性中心的靜態(tài)穩(wěn)定能量很高，生成的化合物不穩(wěn)定。芳環(huán)上氧的σ*孤對(duì)電子，受芳環(huán)上π電子共軛作用，活性較高，與PPO的靜態(tài)穩(wěn)定能更低，生成的化合物更穩(wěn)定。而這一能量數(shù)值與底物鄰苯二酚（463 kcal/mol）幾乎一致，表明抗壞血酸的抑制作用與鄰苯二酚的促進(jìn)作用可構(gòu)成直接競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。而在后續(xù)反應(yīng)中，抗壞血酸的結(jié)合能更高，生成更穩(wěn)定的PPO絡(luò)合物，降低了PPO與底物的接觸濃度，阻止了原雙酚催化循環(huán)的發(fā)生，從而發(fā)揮出防黑變作用。

3 結(jié) 論

4-HR、抗壞血酸均能抑制中華管鞭蝦PPO活力。隨著2 種抑制因子濃度的增加，PPO活力不斷下降，其中，4-HR對(duì)PPO活力的抑制效果強(qiáng)于抗壞血酸。被不同濃度4-HR、抗壞血酸處理的PPO參加的反應(yīng)體系，隨著底物濃度的增加，PPO的Km值逐漸增加，而反應(yīng)體系Vmax趨于相等，符合競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用于酶的特點(diǎn)。4-HR、抗壞血酸與PPO雙銅活性中心的初始結(jié)合能量大小接近，均可與PPO活力中心結(jié)合發(fā)揮抑制效果。在反應(yīng)過(guò)程中，4-HR與PPO會(huì)生成一種高穩(wěn)定絡(luò)合物，持續(xù)有效地消耗PPO，降低酶與底物的接觸濃度，較大程度上抑制黑變。此外，推測(cè)抗壞血酸存在2 種作用機(jī)制，一方面能通過(guò)與PPO活力中心絡(luò)合，直接對(duì)PPO產(chǎn)生抑制作用，另一方面能通過(guò)還原中間產(chǎn)物醛類抑制黑色素的生成。