韓 霜，朱曉琴，裴冬麗

（商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院，植物與微生物互作河南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南商丘476000）

植物對弱光一般有兩種反應(yīng)：服從或逃避。一方面是通過提高葉面積降低葉綠素a/b（Chl a/b）比率來適應(yīng)弱光，另一方面是通過改變?nèi)~片與水平面的角度以便捕獲更多光子來適應(yīng)弱光[1]。弱光條件下光合速率受抑制，從而影響植物生長和產(chǎn)量[2]，同時還會引起葉面積增大，葉綠素含量增加[3]。

光對植物的生長、發(fā)育、形態(tài)、生理，乃至于演化都具有極其重要的作用，而作為同化器官的葉片在弱光環(huán)境中其形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生適應(yīng)性變化，這些在辣椒[4]、茉莉[5]和菊花[6]等多種植物上已有研究報道。淀粉體是白色體的一種，是貯藏光合產(chǎn)物淀粉的一個重要場所，所以它的多少能夠反映光合效率的大小[7]。葉綠體是行使光合作用的細(xì)胞器，最易受到傷害，短期弱光促使基粒片層加厚以適應(yīng)弱光[8]。隨著弱光處理時間的延長，葉綠體膨脹變大內(nèi)部出現(xiàn)裂縫和孔洞，基質(zhì)片層腫脹[5]，通過分析馬鈴薯[9]、花生[10]等物種耐弱光與超微結(jié)構(gòu)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，耐弱光性強(qiáng)的種或品種超微結(jié)構(gòu)受傷害程度較小。一般認(rèn)為，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶是植物體內(nèi)乙烯生物合成的關(guān)鍵酶，其活性大小決定著乙烯的生物量[11]。一些研究認(rèn)為乙烯伴隨著庇陰癥狀產(chǎn)生，而且低濃度的乙烯引起弱光條件下西紅柿莖伸長[12]。光系統(tǒng)Ⅱ捕光色素蛋白包括6種蛋白質(zhì)，Lhcb1、Lhcb2和Lhcb3基因編碼三聚體多肽為LHCII蛋白[13]，前期研究發(fā)現(xiàn)Lhcb1基因在轉(zhuǎn)錄水平上受光的調(diào)控[14]。

菊花品種較多，對光照的適應(yīng)性差異明顯，本研究以清露和公子2個對弱光響應(yīng)差異的2個品種為試驗(yàn)材料，設(shè)置自然光照和重度遮陰2個處理，分析這2個菊花在形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和基因等方面對弱光響應(yīng)差異，為探索光能高效利用機(jī)制提供依據(jù)，為設(shè)施菊花生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 生長條件和遮陰處理

供試材料為弱光敏感品種清露和非敏感品種公子，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資料保存中心提供。選擇生長一致的插穗扦插，生根后移植到口徑14 cm大小的花盆中，所用基質(zhì)配方為營養(yǎng)土∶珍珠巖∶蛭石=1∶1∶1，不施營養(yǎng)液。緩苗后，隨機(jī)分組，光照度分別是：自然光照（對照，中午12時平均光合有效輻射830～1 260μmol/m2s）和20%自然光照（弱光處理160～260μmol/m2s），每個處理60盆。試驗(yàn)期間，溫度、光周期和相對濕度分別是：28/15℃，13/11 h和70%。所有植株接受自然降水，需要水分時灌溉，自然光照條件2 d一次，遮陰條件下每3～4天一次，分別在0、1、2、3和4 d上午11：00取樣，處理20 d后出現(xiàn)明顯的節(jié)間變長、葉柄變長、葉片變薄變大等庇陰癥狀時取樣。

1.2 節(jié)間長、葉柄長、葉面積和比葉重

每個處理5株，從上往下數(shù)第4片完全展開葉，測量4～5葉片的節(jié)間，然后把葉片平展放到信封中，LI-3100C葉面積儀（LI-COR，Lincoln，NE，USA）測定葉面積后放到80℃烘箱中，烘干稱重。比葉重（SLW，g/m2）=干重/葉面積。

1.3 莖剖面結(jié)構(gòu)和葉片超微結(jié)構(gòu)

石蠟切片制作參照李正理[15]的方法。取葉脈兩側(cè)部位5 mm×1 mm大小的樣品，用2.5%戊二醛抽氣4～5 min進(jìn)行固定，然后送電鏡室完成緩沖液沖洗、鋨酸固定、乙醇梯度脫水、丙酮置換滲透、包埋、染色等步驟[16]，最后選擇典型視野觀察、拍照。

1.4 CmLhcb2和CmACO2基因的表達(dá)

根據(jù)菊花腦轉(zhuǎn)錄組信息，葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因Lhcb2、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶基因ACO2特異引物和定量內(nèi)參引物GAPDH，引物序列見表1。

表1 用于熒光定量PCR分析的基因引物序列Table 1 Primer sequence used for real-time quantitative PCR analysis

1.5 統(tǒng)計分析

結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。利用SPSS v17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計分析和雙因素分析，P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長發(fā)育和形態(tài)

光照強(qiáng)度影響植物生長和葉片形態(tài)，20 d時，弱光條件下，出現(xiàn)節(jié)間變長、葉柄變長、葉片變薄變大等庇陰癥狀（見表2）。

表2 不同菊花品種在自然光照、20%自然光照條件下處理20 d節(jié)間長、葉柄長和葉面積Table 2 The length of the stem，internode and petiole，and the leaf area of different Chrysanthemum cultivars exposed to full sunlight and 20% irradiance for 20 days

圖1 菊花品種清露解剖結(jié)構(gòu)Figure 1 The anatomical structure of Chrysanthemum cultivar Puma Sunny

2.2 莖解剖結(jié)構(gòu)和葉綠體超微結(jié)構(gòu)

2個品種的莖均由表皮、皮層、維管束和初生木質(zhì)部4部分組成（圖1、圖2），自然光照條件下細(xì)胞形狀規(guī)則、排列緊密，弱光條件下清露細(xì)胞呈不規(guī)則變形，皮層以內(nèi)的維管束細(xì)胞更為明顯（圖1C，1D），公子受到的影響較?。▓D2）。20%光照使清露葉肉細(xì)胞內(nèi)淀粉粒減少，葉綠體變長（圖3B），基質(zhì)片層排列松弛（圖3D）；公子葉肉細(xì)胞內(nèi)淀粉粒受到的影響較小，葉綠體長度變化不明顯（圖4B），基粒片層較規(guī)則（圖4D）。

圖2 菊花品種公子解剖結(jié)構(gòu)Figure 2 The anatomical structure of Chrysanthemum cultivar Gongzi

圖3 清露在不同光照條件下葉綠體超微結(jié)構(gòu)Figure 3 The chloroplast ultrastructure of Chrysanthemum cultivar Puma sunny under different light conditions

圖4 公子在不同光照條件下葉綠體超微結(jié)構(gòu)Figure 4 The chloroplast ultrastructure of Chrysanthemum cultivar Gongzi under different light conditions

2.3 CmLhcb2和CmACO2基因的表達(dá)

在弱光條件下，清露和公子CmLhcb2均有不同程度的上調(diào)。20%光照條件下，清露在0～4 d快速上調(diào)，第2天時達(dá)顯著水平，3 d時比自然光照條件下高1.57倍，隨后下降（圖5A），公子CmLhcb2表達(dá)量在0～4 d時逐步上升，弱光處理顯著高于對照，第3天時達(dá)顯著水平（圖5B）；弱光條件下，清露CmACO2在第1天顯著增加，2～4 d緩慢下降（圖5C），公子的CmACO2表達(dá)量在0～4 d時逐步升高（圖5D）。因此，清露葉片CmLhcb2和CmACO2基因表達(dá)對弱光的響應(yīng)比公子更快，清露更敏感。

3 討論與結(jié)論

遮陰使植物形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)發(fā)生變化[5]。但菊花對庇陰的響應(yīng)到目前沒有報道。以前的研究認(rèn)為，遮陰適應(yīng)型花葉萬年青通過擴(kuò)大葉面積來調(diào)整光合適應(yīng)性[17]，低光照能促使干物質(zhì)運(yùn)輸分配用于擴(kuò)大葉面積[18]。本研究發(fā)現(xiàn)弱光條件下，清露出現(xiàn)節(jié)間長、葉柄和葉面積增加等庇陰癥狀，公子不明顯，此結(jié)論與鄒長明等[19]關(guān)于不同品種小豆對弱光的響應(yīng)差異相同，弱光敏感型受到的影響更大。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)弱光改變了葉脈篩管-伴胞復(fù)合體的結(jié)構(gòu)，使同化物的運(yùn)輸受阻，清露受到的影響比公子顯著[20]。本研究發(fā)現(xiàn)弱光引起表皮細(xì)胞和皮層細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則變形，維管束細(xì)胞更為明顯，這個結(jié)論印證了弱光引起物質(zhì)運(yùn)輸不暢，從而導(dǎo)致根冠比下降的結(jié)論。

光合反應(yīng)發(fā)生在葉綠體層膜系統(tǒng)類囊體上，所以類囊體結(jié)構(gòu)決定著光合活性的高低[7]。試驗(yàn)結(jié)果顯示，自然光照下葉綠體結(jié)構(gòu)發(fā)育良好，基粒片層和基質(zhì)片層排列整齊（圖3A、C）。同時20%弱光條件下，清露葉綠體細(xì)長，基質(zhì)片層和基粒片層都受到嚴(yán)重破壞（圖3A、C），說明20 d時20%自然光照影響到葉綠體的發(fā)育。20%弱光條件下公子基粒片層加厚，這與前人在馬鈴薯的研究結(jié)果相似[9]，因?yàn)轭惸殷w垛疊高是植物最大限度利用光能的一種適應(yīng)方式；類囊體垛疊使LHCII間連接更緊密，可增加捕光能力和能量傳遞效率[21]。淀粉體是貯藏光合產(chǎn)物淀粉的一個重要場所，20%弱光條件下，清露淀粉粒數(shù)量顯著下降，下降幅度比公子大?；谝陨险撌?，說明在20%光照條件下，公子比清露的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

在高等植物的發(fā)育過程中，光不但直接參與光合作用，而且還作為一種重要的信號物質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[22]。葉綠素a/b結(jié)合蛋白（LHC）是核基因編碼的類囊體蛋白，是由定位于核內(nèi)的cab基因編碼，Lhcb2是編碼光系統(tǒng)Ⅱ蛋白的其中一個基因，低等生物綠藻在50μmol/m2s光強(qiáng)下表達(dá)量比在200μmol/m2s光強(qiáng)下都高[23]，與以上結(jié)論一致，弱光處理使菊花Lhcb2轉(zhuǎn)錄水平提高。低光照會引起莖徒長，乙烯參與到莖伸長的調(diào)控中[24]，對向日葵的研究發(fā)現(xiàn)，處理7 d時，10μmol/m2s光照條件下的乙烯水平極顯著高于1 000μmol/m2s光照條件下的乙烯水平[25]。與以上結(jié)論相同，本研究發(fā)現(xiàn)，弱光條件下乙烯水平與對照相比顯著增加（圖5C、D），清露CmACO2在第1天出現(xiàn)個峰值，公子CmACO2在1～4 d逐漸增加，說明清露在基因調(diào)控方面比公子更敏感。

圖5 CmLhcb2和CmACO2在不同光照條件下的表達(dá)分析Figure 5 Expression analysis of CmLhcb2 and CmACO2 under different conditions

由此可見，在基因水平上，2種菊花葉片的CmLhcb2和CmACO2在弱光條件下都顯著增加，清露受到的影響更顯著，而且比公子反應(yīng)更早；生長狀況和組織結(jié)構(gòu)方面，清露隨著弱光處理時間的延長，柵欄組織和類囊體結(jié)構(gòu)組織細(xì)胞出現(xiàn)畸形，公子在弱光條件下作了適應(yīng)性調(diào)整來抵御弱光脅迫。