申春一 張 震 田永貴 張 毅

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細胞治療中心，鄭州450052)

在腫瘤免疫治療中，過繼性細胞免疫治療(Adoptive cell therapy，ACT)作為一種新興的腫瘤治療策略，發(fā)展迅速，T細胞免疫治療在其中扮演著重要的角色[1]。但T細胞在體外培養(yǎng)過程中大部分走向終末分化狀態(tài)，其抗腫瘤效應(yīng)受到局限[2]。CD8+記憶性T細胞(memory T cell，Tm)包括中心記憶性T細胞(central memory T cell，Tcm)、效應(yīng)記憶性T細胞(effector memory T cell，Tem)和干細胞樣T細胞(T memory stem cell，Tscm)。由于其分化狀態(tài)低、體內(nèi)存活時間長，同時具有較強的抗腫瘤效應(yīng)，因此在免疫治療中展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢[3，4]。其中，Tscm由靜息狀態(tài)的T細胞(naive T cell，Tn)發(fā)育而來，是介于Tn與Tcm之間的一群細胞，同時具有Tn細胞和Tm細胞的特性，可以分化為Tcm細胞和Tem[5]。與Tn相比，Tscm向腫瘤部位趨化及分泌細胞因子的能力較強[6]；與Tem和效應(yīng)性T細胞(effector T cell，Teff)相比，Tscm具有較強的增殖和自我更新能力[7]。將Tscm用于免疫治療，能獲得更好的療效。因此，如何在體外大量擴增Tscm細胞并提高其抗腫瘤能力是目前研究的重點。T細胞的分化受多種因素的影響，記憶亞群的形成受到信號通路的調(diào)控，Wnt通路的激活可有效促進CD8+T細胞向記憶亞群分化[8]。TWS119為4,6-二取代吡咯并嘧啶，可通過抑制糖原合成酶-3β(Glycogen-sythase kinase-3β，GSK-3β)的磷酸化，激活Wnt-β-連環(huán)蛋白通路，促進Tscm亞群的形成[9]。在培養(yǎng)體系中加入細胞因子如IL-7、IL-15、IL-21也可有效誘導(dǎo)Tm細胞的產(chǎn)生[10]。本研究旨在探索體外采用TWS119聯(lián)合不同細胞因子培養(yǎng)對CD8+T細胞分化及功能的影響，篩選最優(yōu)組合，為記憶T細胞在臨床治療中的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國HyClone公司，人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司，流式熒光抗體均購自美國Biolegend公司，Human CD8 microbeads購自德國美天旎公司，Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28購自美國Thermo Fisher Scientific公司，TWS119購自美國Selleck Chemicals公司，重組人白介素-2購自北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司，重組人白介素-7、重組人白介素-15、重組人白介素-21均購自美國peprotech公司。

1.2方法

1.2.1外周血單個核細胞的分離 無菌條件下采集健康供者的外周血10 ml于肝素抗凝采血管中，室溫下1 500 r/min離心10 min；將上層血清移至無菌離心管中-80 ℃保存，下層細胞移至50 ml離心管中，加入PBS稀釋至30 ml；取另一支50 ml離心管，加入淋巴細胞分離液15 ml，離心管呈45°傾斜，用無菌吸管將稀釋后的血液緩慢加于淋巴細胞分離液的液面上；2 500 r/min離心25 min；離心結(jié)束后用無菌吸管小心吸取白膜層置于另一無菌離心管中，加入適量PBS，1 500 r/min離心10 min，得到的沉淀即外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)。

1.2.2細胞免疫磁珠分選 將分離出的PBMCs用磁分選緩沖液重懸，于顯微鏡下細胞計數(shù)后，1 500 r/min 離心10 min，棄上清；每1×107個細胞加入80 μl 磁分選緩沖液和 20 μl 人CD8磁珠混勻，避光4 ℃孵育20 min。孵育后加入適量磁分選緩沖液，1 500 r/min離心10 min，棄上清。將磁分選柱用配套的適配器固定于磁場中，柱下放置收集管，加入適量緩沖液潤洗后，將細胞懸液緩慢加入柱內(nèi)，待柱內(nèi)液體滴盡后，再使用緩沖液洗柱2次。取一支50 ml離心管，將柱取下用活塞加壓將細胞收集至離心管內(nèi)，即為CD8+T細胞。

1.2.3CD8+T細胞體外處理及培養(yǎng) CD8+T細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞密度為1×106ml-1，同時加入CD3/CD28活化磁珠，將細胞鋪于24孔板中，每孔1×106個細胞。實驗共設(shè)置10組，分別是對照組、TWS119單獨處理組、IL-7+IL-15處理組、IL-7+IL-15+TWS119聯(lián)合處理組、IL-7+IL-21處理組、IL-7+IL-21+TWS119聯(lián)合處理組、IL-15+IL-21處理組、IL-15+IL-21+TWS119聯(lián)合處理組、IL-7+IL-15+IL-21處理組、IL-7+IL-15+IL-21+TWS119聯(lián)合處理組。人IL-7、IL-15重組蛋白的濃度為5 ng/ml，人IL-21重組蛋白的濃度為20 ng/ml，TWS119的濃度為5 μmol/L，處理 6 d 后進行檢測。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測不同處理組CD8+T細胞分化及表面分子表達情況 CD8+T細胞經(jīng)分組處理 6 d 后，將每組細胞分為2管，收集于1.5 ml離心管中，1 500 r/min 離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細胞，離心棄上清后避光加入流式表面抗體CD8-APC-Cy7，CD45RA-PerCP，CD62L-PE，CD95-PE-Cy7，每組的2管細胞分別加入抗體CD27-FITC、CD28-APC和 PD-1-FITC、Tim-3-APC。避光4 ℃孵育20 min后使用流式細胞儀檢測CD8+T細胞亞群及表面分子表達情況。以CD45RA及CD62L區(qū)分CD8+T細胞的不同亞群：CD45RA+CD62L+為CD8+Tn細胞；CD45RA-CD62L+為CD8+Tcm細胞；CD45RA-CD62L-為CD8+Tem細胞；CD45RA+CD62L+CD95+為CD8+Tscm細胞。

1.2.5細胞內(nèi)因子檢測 各組細胞體外培養(yǎng)6 d后，分別加入PMA(50 mg/L)、離子霉素(750 mg/L)和阻斷劑BFA(1×)，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。后將每組細胞分2管收集于1.5 ml離心管中，1 500 r/min離心5 min，棄上清。用PBS洗滌細胞，離心棄上清后避光加入流式表面抗體CD8-APC-Cy7、CD45RA-PerCP、CD62L-PE、CD95-PE-Cy7，避光4 ℃孵育20 min，每管加入200 μl 4%多聚甲醛固定，4 ℃避光固定30 min后，1 500 r/min離心5 min，棄上清。加入10×破膜劑200 μl，4 ℃避光孵育1 h，1 500 r/min離心5 min，棄上清。每組的2管細胞分別避光加胞內(nèi)抗體IFN-γ-APC、TNF-α-APC，4 ℃避光孵育20 min。使用流式細胞儀檢測細胞因子分泌情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.6細胞抗凋亡能力檢測 將各組細胞收集于1.5 ml離心管中，用PBS清洗2遍，棄上清，加200 μl Annexin V binding buffer重懸，避光加入流式抗體CD8-PE，Annexin V-APC，避光4 ℃孵育20 min，上樣前加入抗體碘化丙啶(Propidium iodide，PI)，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1IL-7+IL-21+TWS119聯(lián)合處理促進CD8+T細胞向記憶亞群分化 體外采用不同細胞因子聯(lián)合TWS119培養(yǎng)處理CD8+T細胞6 d后，經(jīng)流式細胞儀檢測CD8+T細胞亞群比例(圖1A)。結(jié)果顯示，與對照組相比，IL-7+IL-21+TWS119聯(lián)合處理組中Tcm細胞的比例明顯增加(圖1B)[(8.23±3.46)% vs (30.80±4.53)%，P<0.05]。進一步分析其倍數(shù)，結(jié)果顯示IL-7+IL-21+TWS119組合Tcm的增殖倍數(shù)是對照組的3倍，說明該組合能有效擴增Tcm細胞。同時，Tscm細胞的比例也顯著提升(圖2)[(13.00±1.68)% vs (56.70±6.24)%，P<0.001]。提示采用IL-7+IL-21+TWS119處理可顯著促進Tcm細胞和Tscm細胞形成，有效抑制CD8+T細胞向終末狀態(tài)分化。由此可見，該組合為各實驗組中促進記憶亞群形成的最優(yōu)組合。

圖1 CD8+T細胞經(jīng)不同組合處理后各亞群變化情況Fig.1 Subsets of CD8+T cells treated with different groupsNote: A.The proportion of subsets among CD8+T cells in different groups;B.Frequencies of Tcm among CD8+T cells in different groups.Vs control group，*.P<0.05.

2.2IL-7+IL-21+TWS119聯(lián)合處理對CD8+T細胞表面分子表達的影響 流式細胞分析技術(shù)檢測CD8+T細胞表面激活及抑制型分子的表達情況，結(jié)果顯示，經(jīng)處理后，CD8+T細胞表面激活型標志CD28和CD27表達水平與對照組相比均有不同程度升高(圖3)，且以IL-7+IL-21+TWS119組合變化最為顯著[CD28:(18.28±3.57)% vs(62.08±10.64)%，P<0.001;CD27:(15.73±4.864)% vs(70.97±2.39)%，P<0.01]。同時表面抑制型分子PD-1及Tim-3表達水平檢測結(jié)果顯示(圖4)：抑制型分子表達水平較對照組顯著下調(diào)[PD-1:(11.73±3.04)% vs(3.133±0.31)%，P<0.001;Tim-3:(14.33±2.03)% vs(2.77±0.31)%，P<0.001]。結(jié)果提示：TWS119聯(lián)合IL-7、IL-21可顯著活化CD8+T細胞，誘導(dǎo)CD28和CD27表達水平升高，PD-1和Tim-3表達水平下調(diào)。

圖2 CD8+T細胞經(jīng)不同組合處理后Tscm亞群變化情況Fig.2 Frequencies of Tscm among CD8+T cells in different groupsNote: Vs control group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 CD8+T細胞經(jīng)不同組合處理后表面激活型分子表達情況Fig.3 Activating markers of CD8+T cells after treated with different groupsNote: Frequencies of CD28+(A) and CD27+(B) cells in CD8+T cells.Vs control group;*.P<0.05，**.P<0.01;***.P<0.001.

2.3IL-7+IL-21+TWS119聯(lián)合處理促進CD8+T細胞內(nèi)因子的分泌 與對照組相比，IL-7+IL-21+TWS119處理后的CD8+T細胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平明顯提高(圖5A、B)[IFN-γ:(9.65±2.56)% vs(35.98±8.04)%，P<0.001;TNF-α:(12.13±3.11)% vs(44.10±2.43)%，P<0.001]。進一步分析對照組與IL-7+IL-21+TWS119組平均熒光強度(MFI)，結(jié)果顯示與對照組相比，加入IL-7+IL-21+TWS119后，IFN-γ和TNF-α陽性細胞的MFI均顯著升高(圖5C、D)[IFN-γ:(2.97±0.83)% vs(8.43±0.87)%，P<0.05;TNF-α:(2.23±0.44)% vs(6.27±0.41)%，P<0.05]。上述結(jié)果提示：TWS119聯(lián)合細胞因子IL-7、IL-21可明顯增強CD8+T細胞抗腫瘤能力，IFN-γ和TNF-α等細胞因子分泌水平均顯著升高。

圖4 CD8+T細胞經(jīng)不同組合處理后表面抑制型分子表達情況Fig.4 Inhibitory markers of CD8+T cells after treated with different groupsNote: Frequencies of PD-1+(A) and Tim-3+(B) cells in CD8+T cells.Vs control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4IL-7+IL-21+TWS119聯(lián)合處理增強CD8+T細胞抗凋亡能力 采用不同組合處理CD8+T細胞后，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況(圖6)。與未處理組相比，處理組的CD8+T細胞凋亡比例明顯減少，其中IL-7+IL-21+TWS119處理組凋亡細胞比例減少最為顯著[(21.28±2.25)% vs(7.80±0.82)%，P<0.001]。結(jié)果表明:采用IL-7+IL-21+TWS119處理CD8+T細胞，可使細胞存活時間在體外培養(yǎng)過程中延長，抗凋亡能力明顯增強。

圖5 CD8+T細胞經(jīng)不同組合處理后細胞因子分泌情況Fig.5 Cytokine production in CD8+T cells treated with different groupsNote: The secretion of IFN-γ(A) and TNF-α(B) by CD8+T cells.The MFI of IFN-γ(C) and TNF-α(D) of control group and IL-7+IL-21+TWS119 group.Vs control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖6 CD8+T細胞經(jīng)不同組合處理后細胞凋亡情況Fig.6 Apoptosis of CD8+T cells treated with different groupsNote: A.The percentage of apoptotic cells of CD8+T cells;B.Flow cytometry gating strategy for apoptosis of CD8+T cells.Vs control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

3 討論

T細胞在腫瘤免疫治療中發(fā)揮巨大的作用。細胞毒性T細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)在激活后，可通過分泌顆粒酶、穿孔素、細胞因子等介質(zhì)介導(dǎo)腫瘤細胞裂解死亡；另外，CTL細胞表面的FASL可結(jié)合腫瘤細胞表面的FAS分子，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[11]。在ACT治療過程中，T細胞在體外培養(yǎng)會大量向終末期分化，這類細胞在體內(nèi)存活能力較弱，影響免疫治療的療效[2，12]。因此如何在體外獲得壽命較長且抗腫瘤能力較強的CD8+記憶性T細胞尤為重要。本研究發(fā)現(xiàn)TWS119聯(lián)合細胞因子可有效誘導(dǎo)CD8+T細胞向記憶亞群分化，經(jīng)最優(yōu)組合IL-7+IL-21+TWS119處理后可獲得大量具有更強抗腫瘤能力的CD8+記憶性T細胞。

有研究報道，TWS119作為Wnt-β-連環(huán)蛋白通路的激活劑，可有效誘導(dǎo)CD8+記憶性T細胞，尤其是Tscm亞群的產(chǎn)生。Forget等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將TWS119作用于健康人PBMC和肺癌患者腫瘤浸潤淋巴細胞，Tscm亞群形成增多。但是該研究的內(nèi)因子檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TWS119處理后，CD8+T細胞分泌促炎因子減少。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)處理后CD8+T細胞內(nèi)因子分泌水平升高，可能由于同時聯(lián)合細胞因子處理可更有效增強CD8+T細胞的抗腫瘤效應(yīng)。除激活Wnt通路外，Scholz等[14]的研究證實了TWS119可同時抑制mTOR通路并促進Tscm細胞的形成。為我們揭示了TWS119誘導(dǎo)Tscm形成的另一條通路。

T細胞的體外培養(yǎng)需要細胞因子的參與，加入不同細胞因子可影響T細胞的增殖和分化。IL-7是非造血干細胞來源的一類細胞因子，與其受體IL-7Rα結(jié)合后，激活Jak3-Stat5通路，上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2和Mcl-1的表達，抑制Bax和Bak等促凋亡蛋白的形成，維持Tn和Tm細胞的生存[15]。IL-15是一種免疫刺激因子，具有促進T細胞增殖，誘導(dǎo)其活化，并有助于抗原特異性CD8+Tm細胞的形成和其表型的維持[16]。有研究顯示，IL-7聯(lián)合IL-15在體外培養(yǎng)Tn細胞，得到大量存活時間長且抗腫瘤能力強的Tscm細胞，并在免疫缺陷小鼠中進行了體內(nèi)功能驗證[17]。Chapuis等[18，19]將來源于惡性黑色素瘤患者的CTL細胞用IL-21處理后，功能得到增強并誘導(dǎo)記憶性T細胞形成，同時聯(lián)合CTLA-4單抗用于難治性惡性黑色素瘤的治療，腫瘤得到有效控制。在Zoon等[20]的工作中，將乳腺癌小鼠引流淋巴結(jié)的淋巴細胞分別用IL-2、IL-21、IL-2+IL-21、IL-7+IL-15和IL-7+IL-15+IL-21培養(yǎng)。結(jié)果顯示，與其他組合相比，IL-7+IL-15+IL-21培養(yǎng)體系可誘導(dǎo)大量Tcm細胞形成，IL-21及IL-2+IL-21的培養(yǎng)體系可促進大量Tn細胞產(chǎn)生，并顯著提高IFN-γ分泌水平。在本研究中，采用IL-7+IL-21組合或IL-7+IL-15+IL-21組合聯(lián)合TWS119培養(yǎng)CD8+T細胞，均可顯著促進CD8+T細胞記憶表型的形成，同時增強其抗腫瘤效應(yīng)，但是兩組合之間并無差異，因此IL-7+IL-21聯(lián)合TWS119在本研究中為最優(yōu)組合。

嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptors，CAR)T細胞是免疫治療在腫瘤治療應(yīng)用中的重大突破之一，于2017年8月已被FDA批準應(yīng)用于急性淋巴細胞白血病的治療。Sabatino等[21]采用IL-7+IL-21聯(lián)合TWS119在體外誘導(dǎo)出大量Tscm細胞，再進行目的基因的轉(zhuǎn)染，獲得了可用于臨床的CD19-CAR-Tscm細胞。與普通CAR-T細胞相比，經(jīng)處理的CD19-CAR-Tscm細胞具有更強的抗腫瘤能力。研究表明，利用低分化狀態(tài)細胞制備CAR-T細胞可獲得更好療效，展現(xiàn)了細胞因子和信號通路激活劑在CAR-T細胞臨床應(yīng)用中的廣闊前景。

本研究發(fā)現(xiàn)，細胞因子聯(lián)合小分子化合物TWS119可誘導(dǎo)記憶性CD8+T細胞分化，特別是Tscm亞群的形成，并有效增強T細胞功能。根據(jù)前期結(jié)果我們篩選出最優(yōu)組合：IL-7+IL-21+TWS119。本研究優(yōu)化CD8+T細胞體外培養(yǎng)體系，獲得大量存活時間長、抗腫瘤能力強的記憶性CD8+T細胞，并為其臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。