許東風(fēng) 楊東明 馮云枝 楊明生

(南陽醫(yī)專第一附屬醫(yī)院,南陽473000)

放療性肺損傷是癌癥放療最常見的并發(fā)癥，包括早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纖維化[1-3]。研究表明，超過30%接受放療的肺癌、乳腺癌和淋巴瘤患者都會(huì)出現(xiàn)放射性肺損傷，其高發(fā)病率極大地限制了放療的劑量并增加了胸部惡性腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[4]。大量研究表明，氧化應(yīng)激和大量炎癥因子的釋放與放射性肺損傷密切相關(guān)，其參與了放療誘導(dǎo)的肺炎及肺纖維化[5-8]。因此，尋找新的藥物抑制放療后肺部氧化應(yīng)激及炎癥因子的釋放對(duì)減輕放療并發(fā)癥具有重要意義。肉蓯蓉是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)藥[9]，現(xiàn)代研究表明其具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗衰老、抗炎、抗氧化和抗脂質(zhì)過氧化的功能[10-12]。肉蓯蓉A是肉蓯蓉的活性成分之一，也有研究表明其具有抗炎和抗氧化活性[13]。本研究將通過復(fù)制放射性肺損傷小鼠模型，探討肉蓯蓉苷A對(duì)肺部氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物 肉蓯蓉苷A購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。分子式為C36H48O20，分子量為800.755(見圖1)，純度>98%，使用時(shí)用吐溫-80助溶，吐溫-80終濃度不超過1%。

1.1.2動(dòng)物 45只清潔級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。自由進(jìn)食進(jìn)水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3試劑 吐溫-80購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。谷胱甘肽過氧化物酶 (Glutathione peroxidase,GSH-PX)、丙二醛 (Malondialdehyde,MDA)、總抗氧化能力 (Total antioxidant capacity,T-Aoc) 和超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase,SOD) 試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。白介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、IL-10和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司?？罐D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (Vascular endothelial growth factor,VEGF) 和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2) 抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，生物素標(biāo)記二抗和HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。

1.1.4儀器 Precise直線加速器購(gòu)自瑞典ELEKTA公司。HBS-1096B酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵公司。垂直電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。生物顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Leica公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型 將45只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為健康組、肉蓯蓉苷A組、放射組和放射+肉蓯蓉苷A組。用10%水合氯醛麻醉小鼠，放射組和放射+肉蓯蓉苷A組小鼠均采用加速器X射線單次照射，總劑量為20 Gy。X射線照射4 h后，肉蓯蓉苷A組和放射+肉蓯蓉苷A組小鼠灌胃給予肉蓯蓉苷A，0.5 g/kg；健康組和放射組小鼠給予等量溶媒，每天一次，30 d后處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

圖1 肉蓯蓉苷A的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure formula of Cistanoside A

1.2.2Tunel檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用4%多聚甲醛室溫固定肺組織2 h后制作肺組織冰凍切片，并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。臨用前取出相同部位切片，于室溫放置45 min后，用緩沖液清洗3次，每次10 min。根據(jù)Tunel試劑盒說明書檢測(cè)小鼠肺組織凋亡小體形成情況。

1.2.3GSH-PX、MDA、T-Aoc、SOD、IL-6、IL-1β和IL-10濃度檢測(cè) 取各組小鼠相同部位肺組織，制作肺勻漿，3 000 r/min離心20 min，取上清液，根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)肺勻漿中GSH-PX、MDA、T-Aoc、SOD、IL-6、IL-1β和IL-10濃度。

1.2.4免疫組化檢測(cè)TGF-β1的表達(dá) 取冰凍切片復(fù)溫后，用PBS緩沖液清洗3次，加入檸檬酸鈉進(jìn)行抗原修復(fù)。待切片自然冷卻并清洗后，滴加5%封閉用山羊血清室溫封閉切片2 h。封閉完成后，滴加抗TGF-β1抗體于4℃孵育過夜，抗體濃度為1∶200。第2天滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h，洗滌3次，滴加辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白工作液，37℃孵育15 min，用DAB顯色，蘇木精復(fù)染、封片，用生物顯微鏡拍片記錄，每片選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。

1.2.5Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 取相同部位肺組織并剪碎，用RIPA裂解液提取肺組織蛋白，BCA試劑盒對(duì)其進(jìn)行定量分析。用10%SDS-PAGE分離蛋白、轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜后，用5%BSA室溫封閉蛋白2 h，加入一抗4℃封閉過夜。第二天洗去一抗(TGF-β1，1∶1 000；VEGF，1∶1 200；VEGFR2，1∶1 000)，加入二抗室溫封閉1 h后，將膜洗凈，滴加化學(xué)發(fā)光液，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白條帶圖片，并用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1肉蓯蓉苷A對(duì)放射性肺損傷小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響 Tunel實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與健康組比較，肉蓯蓉苷A組小鼠肺組織凋亡小體數(shù)目無明顯變化 (P>0.05，圖2)，放射組小鼠肺組織凋亡小體數(shù)明顯增多 (P<0.05，圖2)；與放射組比較，放射+肉蓯蓉苷A組小鼠凋亡小體明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05，圖2)。

2.2肉蓯蓉苷A對(duì)放射性肺損傷小鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響 與健康組比較，放射組小鼠肺組織GSH-PX、T-Aoc和SOD的濃度明顯降低(P<0.05，圖3)，肉蓯蓉苷A組小鼠肺組織GSH-PX、T-Aoc和SOD的濃度無明顯變化 (P>0.05，圖3)；與放射組比較，放射+肉蓯蓉苷A組小鼠肺組織GSH-PX、T-Aoc和SOD的濃度明顯升高 (P<0.05，圖3)；此外，放射組小鼠肺組織MDA濃度與健康組比較明顯升高 (P<0.05，圖3)，放射+肉蓯蓉苷A組小鼠肺組織MDA濃度顯著低于放射組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

圖2 肉蓯蓉苷A對(duì)放射性肺損傷小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of Cis A on cell apoptosis of radiation-induced lung injury in miceNote: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs radiation group.

圖3 肉蓯蓉苷A對(duì)放射性肺損傷小鼠肺組織氧化應(yīng)激的影響Fig.3 Effects of Cis A on oxidative stress of radiation-induced lung injury in miceNote: The concentrations of GSH-Px,T-Aoc,SOD and MDA were measured by kits.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs radiation group.

2.3肉蓯蓉苷A對(duì)放射性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響 ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉蓯蓉苷A對(duì)正常小鼠肺勻漿IL-6 、IL-1β和IL-10濃度無明顯影響 (P>0.05，圖4)；照射后30 d，放射組小鼠肺勻漿IL-6和IL-1β的濃度顯著高于健康組 (P<0.05，圖4)，IL-10濃度與健康組比較明顯降低 (P<0.05，圖4)；放射+肉蓯蓉苷A組小鼠肺勻漿IL-6和IL-1β的濃度明顯降低 (P<0.05，圖4)，IL-10濃度明顯升高 (P<0.05，圖4)，與放射組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 肉蓯蓉苷A對(duì)放射性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of Cis A on inflammation of radiation-induced lung injury in miceNote: The concentrations of IL-6,IL-1β and IL-10 were determined by ELISA assay.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs radiation group.

圖5 肉蓯蓉苷A對(duì)TGF-β1表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Cis A on expression of TGF-β1Note: *.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs radiation group.

圖6 肉蓯蓉苷A對(duì)TGF-β1/VEGF信號(hào)通路的影響Fig.6 Effect of Cis A on TGF-β1/VEGF signaling pathwayNote: The protein levels of TGF-β1,VEGF and VEGFR2 were measured by Western blot,GAPDH was used as loading control.*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs radiation group.

2.4肉蓯蓉苷A對(duì)TGF-β1/VEGF信號(hào)通路的影響 與健康組比較，放射組小鼠肺組織TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05，圖5)，肉蓯蓉苷A組TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)無明顯變化 (P>0.05，圖5)；與放射組比較，放射+肉蓯蓉苷A組小鼠肺組織TGF-β1陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05，圖5)；此外，放射組小鼠肺組織TGF-β1、VEGF和VEGFR2的蛋白表達(dá)水平均顯著高于健康組 (P<0.05，圖6)；放射+肉蓯蓉苷A組小鼠肺組織TGF-β1、VEGF和VEGFR2的蛋白表達(dá)水平與放射組比較均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖6)。

3 討論

放射性肺損傷是胸部惡性腫瘤放療最常見的并發(fā)癥，其高發(fā)病率嚴(yán)重限制了放療在癌癥中的應(yīng)用[14]。目前，對(duì)于放射性肺損傷的機(jī)制還不完全清楚，并且缺乏安全有效的治療藥物。肉蓯蓉苷A具有抗炎、抗氧化活性，且具有肝細(xì)胞保護(hù)功能，但其能否影響放療誘導(dǎo)肺損傷的發(fā)展尚未見報(bào)道[13,15]。研究表明，電離輻射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是放療治療癌癥的主要機(jī)制，但同時(shí)也會(huì)造成正常細(xì)胞大量死亡[16,17]。本文研究發(fā)現(xiàn)，放療能明顯誘導(dǎo)小鼠肺組織正常細(xì)胞凋亡，表明放療可造成小鼠肺損傷。肉蓯蓉苷A能顯著減弱放療對(duì)肺組織凋亡小體形成的誘導(dǎo)作用，減少肺組織正常細(xì)胞凋亡，提示肉蓯蓉苷A可能對(duì)放射性肺損傷模型小鼠具有肺保護(hù)作用。

放射性肺損傷是由多個(gè)細(xì)胞因子共同介導(dǎo)的病理過程[18]。研究表明，放療可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷，從而誘導(dǎo)白細(xì)胞黏附和炎癥因子的大量釋放，如IL-6、TNF-α和IL-1β等[19,20]。其中，IL-6是一類成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，研究表明其與肺功能不全、肺部感染和呼吸道炎癥等多類肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[21-24]。也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6在放射后表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，且基本與放療性肺損傷同時(shí)出現(xiàn)，因此常被作為放療后肺損傷發(fā)生的標(biāo)志。IL-1β在放射后表達(dá)水平也明顯升高[25]。本文研究也表明，放射能顯著升高小鼠肺組織IL-6和IL-1β濃度，同時(shí)還能抑制IL-10的表達(dá)。IL-10是一類炎癥抑制因子，其高表達(dá)能抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生。提示放療能誘導(dǎo)肺組織炎癥反應(yīng)。肉蓯蓉苷A能顯著減弱放療對(duì)IL-6和IL-1β分泌的促進(jìn)作用，同時(shí)還能升高放療性肺損傷小鼠IL-10的分泌量，表明肉蓯蓉苷A能夠通過調(diào)控炎癥因子的釋放減輕放射性肺損傷小鼠肺組織炎癥反應(yīng)，從而減輕小鼠放射性肺損傷。

氧化應(yīng)激是造成放射性肺損傷的重要機(jī)制之一[26]。放療可通過作用于機(jī)體水分子和誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞聚集而促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，造成DNA損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡[27,28]。研究表明，約有60%～70%的放療誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷都與氧化自由基的產(chǎn)生有關(guān)[26,29,30]。SOD是機(jī)體最主要的自由基清除劑。在肺組織中主要由肺泡Ⅱ型肺細(xì)胞分泌產(chǎn)生，其可通過催化超氧陰離子和過氧化氫發(fā)生歧化反應(yīng)而減少活性氧含量[31]。同時(shí)，SOD還能對(duì)抗炎癥反應(yīng)，抑制肺組織纖維化，SOD過表達(dá)能明顯減輕放射性肺損傷小鼠肺部炎癥反應(yīng)和氧化損傷[32]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉蓯蓉苷A能顯著升高放射性肺損傷小鼠肺組織SOD的濃度，同時(shí)還能促進(jìn)GSH-PX和T-Aoc的分泌，抑制放射性肺損傷小鼠肺組織氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生。GSH-PX是一類過氧化物分解酶，T-Aoc反映了機(jī)體的抗氧化能力，提示肉蓯蓉苷A能增強(qiáng)放射性肺損傷小鼠抗氧化能力，抑制肺組織氧化應(yīng)激的發(fā)生。

TGF-β1是參與放射性肺損傷的纖維增生因子，主要由炎性細(xì)胞、間葉細(xì)胞和上皮細(xì)胞合成分泌[33,34]。TGF-β1過表達(dá)可促進(jìn)炎癥反應(yīng)，還能通過誘導(dǎo)活性氧的釋放誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，在放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[35]。抑制TGF-β1表達(dá)可減緩肺纖維化進(jìn)程[36]。肉蓯蓉苷A能顯著減少放療誘導(dǎo)的小鼠肺組織TGF-β1的陽性表達(dá)，同時(shí)還能抑制放射性肺損傷小鼠肺組織TGF-β1、VEGF和VEGFR2的蛋白表達(dá)。VEGF是血管新生的主要誘導(dǎo)因子。研究表明，放療誘導(dǎo)的肝纖維化通常都伴有血管的新生，并且TGF-β1可通過調(diào)控VEGF表達(dá)誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，從而調(diào)控肺組織氧化反應(yīng)[4,37]。結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，肉蓯蓉苷A緩解放射性肺損傷小鼠肺部氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可能與抑制TGF-β1/VEGF信號(hào)通路激活有關(guān)。

綜上所述，肉蓯蓉苷A能抑制放射誘導(dǎo)的小鼠肺組織細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥因子的釋放，并且其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/VEGF信號(hào)通路激活有關(guān)。本文僅初步探討了肉蓯蓉苷A對(duì)放療誘導(dǎo)的肺損傷的作用及作用機(jī)制，可能為臨床治療放射性肺損傷提供了一新的候選藥物，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。