阿卜力孜·克熱木 納菲沙·卡德爾 穆拉迪力·約麥爾 阿孜古麗·要力瓦斯 瑪依熱·吐爾哄 夏米西努爾·伊力克

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，烏魯木齊830054)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指婦女在40 歲之前由于各種原因出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng),除 此之外還伴有卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)及促黃體生成素(Luteinizing horm-one,LH)升高,而雌二醇(Estrogen,E2)降低的綜合征[1-4]。機體在遇到各種不利的刺激后，會通過調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)而產(chǎn)生一系列反應(yīng)，謂之應(yīng)激。與應(yīng)激相關(guān)的臨床疾病并不罕見，在生殖內(nèi)分泌疾病如月經(jīng)失調(diào)、無排卵月經(jīng)、閉經(jīng)、不孕、性功能障礙等，慢性應(yīng)激已經(jīng)成為重要的致病因素[5,6]。前期研究通過分析POF大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的形態(tài)學(xué)變化,通過Masson染色及HE染色觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化,初步確認(rèn)POF大鼠的組織形態(tài)學(xué)病因,通過中藥木尼孜其合劑的藥物干預(yù)作用,確認(rèn)其在POF大鼠中對性腺軸的改善作用[1]。本研究在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上研究卵巢炎癥及卵泡發(fā)育成熟有關(guān)蛋白,C3是補體系統(tǒng)的核心,它是啟動補體活化旁路途徑并參與其級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子。CYP51作為生物甾醇合成中的關(guān)鍵酶,可以把甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成 FF-MAS。而FF-MAS是一種促性腺激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的重要信號分子,能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。前期研究通過分析POF大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的形態(tài)學(xué)變化，通過Masson染色及HE染色觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化，初步確認(rèn)POF大鼠的組織形態(tài)學(xué)病因，通過中藥木尼孜其合劑的藥物干預(yù)作用，確認(rèn)其在POF大鼠中對性腺軸的改善作用。本研究在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上研究卵巢炎癥及卵泡發(fā)育成熟的有關(guān)蛋白，C3是補體系統(tǒng)的核心，它是啟動補體活化旁路途徑并參與其級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子。CYP51作為生物甾醇合成中的關(guān)鍵酶，可以把甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成FF-MAS。而FF-MAS是一種促性腺激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的重要信號分子，能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及其分組 通過陰道涂片實驗篩選出清潔級兩月齡左右的性成熟雌性Wistar大鼠90只，平均體質(zhì)量為230～250 g，實驗動物由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后，開始進(jìn)行造模。隨機抽取10只為正常對照組(C組)，其余80只為造模組。

1.1.2主要試劑及儀器 (RXZ型)人工氣候箱(寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司)；ZBY-149-83型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；臺式高速離心機HC-16(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；兔多克隆抗體CYP51、兔單克隆抗體C3(美國Abcam公司)；菠菜實、芫荽籽，JEM-1230型透射式電子顯微鏡(日本電子&美國GATAN)；徠卡DM3000數(shù)碼顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)。

1.2方法

1.2.1慢性應(yīng)激致POF大鼠模型的建立 模型大鼠置于人工氣候箱中飼養(yǎng)，溫度為(6±1)℃，濕度為(85±5)%，每日北京時間10：00至20：00放入。在濕寒環(huán)境下飼養(yǎng)。在造模過程中，C組每日給予常規(guī)飼料500 g，飲用水500 ml以及木屑墊料150 g。慢性應(yīng)激模型組每日給予濕寒屬性飼料500 g，飲用水及墊料給予量與正常組一致。正常組與慢性應(yīng)激模型組均隨機飲食水，每周選擇同一固定時間點觀測并記錄生物學(xué)表征如體重、進(jìn)食量、飲水量、尿量以及大便量等并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[1]。

1.2.2正常對照組 常規(guī)環(huán)境(溫度:20℃±2℃，濕度:55%～65%)中飼養(yǎng)，每日隨機飲食水。模型組與正常對照組進(jìn)行每日12 h人工照明，并定時觀測各組大鼠生物學(xué)表征的變化。

1.2.3應(yīng)激組及POF組大鼠的分組及藥物干預(yù) 建立慢性應(yīng)激動物模型，從大鼠眼眶靜脈叢進(jìn)行采血并通過放射免疫法檢測外周血清中E2、LH及FSH的激素含量，慢性應(yīng)激模型組各大鼠激素含量與正常組大鼠激素含量做比較，并結(jié)合慢性應(yīng)激組各大鼠發(fā)情周期的變化篩選出POF模型動物，將其隨機分為POF模型組(P組)、POF藥物干預(yù)高劑量組(PTH組)、POF藥物干預(yù)中劑量組(PTM組)、POF藥物干預(yù)低劑量組(PTL組)；未成POF的慢性應(yīng)激模型動物隨機分為應(yīng)激模型組(S組)、應(yīng)激藥物干預(yù)高劑量組(STH組)、應(yīng)激藥物干預(yù)中劑量組(STM組)、應(yīng)激藥物干預(yù)低劑量組(STL組)。應(yīng)激模型組及應(yīng)激藥物干預(yù)組共48只大鼠，用于其他實驗研究。上述藥物干預(yù)組動物用中藥木尼孜其合劑分高、中、低三種劑量灌胃，藥物干預(yù)時間為2周。在藥物干預(yù)期間每3 d進(jìn)行生物學(xué)表征的觀察與記錄，最后與正常組大鼠進(jìn)行比較分析。

1.2.4觀察指標(biāo) 給藥結(jié)束后將所有大鼠采用10% 水合氯醛，按照所稱體重3 ml/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，速取大鼠卵巢組織，卵巢組織用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定，隨后進(jìn)行石蠟包埋切片，卵巢組織切片采用免疫組織化學(xué)的方法檢測大鼠卵巢組織中C3與CYP51蛋白的表達(dá)。

1.2.5免疫組織化學(xué)方法 每個樣本隨機選取10個視野并保證各視野之間完全不重疊，采用陽性細(xì)胞計數(shù)法，每組一般為7～10個不同樣本，隨后進(jìn)行組間比較。評分方法通過陽性范圍和著色強度兩方面進(jìn)行。其中陽性范圍是指陽性細(xì)胞所占的百分率，分為5個等級，即0(<5%)、1(6%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)、4(>75%)；著色強度是指陽性細(xì)胞染色的深淺程度，分為4個等級，即0(幾乎不著色或者有一點著色)、1(著色但比較淺)、2(著色且比較深)、3(著色非常深)；最終結(jié)果為陽性范圍×著色強度×25。

2 結(jié)果

2.1卵巢電鏡結(jié)果 為了觀察卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的變化，用戊二醛固定之后切片在電鏡下進(jìn)行觀察，如圖1所示，正常組大鼠顆粒細(xì)胞核清晰，核仁清晰，線粒體豐富，可見少量溶酶體，偶見線粒體輕微腫脹；POF組大鼠細(xì)胞基質(zhì)溶解，細(xì)胞核膜溶解，核仁結(jié)構(gòu)不清晰，線粒體溶解，細(xì)胞不完整，出現(xiàn)大量纖維彌漫性增生； PTH組大鼠出現(xiàn)異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象，細(xì)胞核清晰可見，核仁清晰，顆粒細(xì)胞形體正常，細(xì)胞間隙比較致密；PTM組大鼠線粒體輕微腫脹，吞飲泡較多，細(xì)胞核外形較規(guī)則；PTL組大鼠吞飲泡多，基質(zhì)壞死較嚴(yán)重，細(xì)胞核固縮，線粒體收縮等。

2.2C3的表達(dá) 如圖2所示，C3蛋白在各組卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá)，間質(zhì)以及在黃體中不表達(dá)或低表達(dá)，C3蛋白主要在正常組大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá)，黃體中少量表達(dá)；在POF組中大鼠顆粒層細(xì)胞、黃體及間質(zhì)中高度表達(dá)；經(jīng)過藥物干預(yù)C3蛋白在各組卵巢中的表達(dá)呈不同程度下降趨勢。如表1、圖3所示，POF組大鼠卵巢C3蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別升高了154.17%。經(jīng)過統(tǒng)計分析其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PTH組、PTM組、PTL組大鼠卵巢C3蛋白表達(dá)較POF組大鼠分別降低了13.22%、12.57%、8.19%，其中PTH組、PTM組與POF組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與PTL組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組大鼠卵巢電鏡圖Fig.1 Ovarian sections of each group rats under electron microscope

圖2 C3在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)(×200)Fig.2 Expression of C3 in ovarian tissue of rats in each group(×200)

2.3CYP51的表達(dá) 如圖4所示，CYP51蛋白在各組卵巢間質(zhì)以及在黃體中高表達(dá)，在卵泡顆粒層細(xì)胞中不表達(dá)，CYP51在正常組大鼠黃體及在間質(zhì)中高表達(dá)，顆粒層細(xì)胞中不表達(dá)，其在POF組大鼠中的表達(dá)明顯下降，經(jīng)過藥物干預(yù)，在各劑量藥物干預(yù)組中不同程度的升高。如表2、圖5所示，POF組大鼠卵巢CYP51蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別下降了57.22%、46.08%，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PTH組、PTM組、PTL組大鼠卵巢CYP51蛋白表達(dá)較POF組大鼠分別升高了77.13%、23.14%、19.95%，其中PTH組與POF組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，PTL組、PTM組與POF組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

GroupsnExpression of C3F valueP valueNormal83.60±0.5526.1530.000POF89.15±0.971)PTH87.94±0.692)PTM88.00±1.042)PTL88.40±0.68

Note：Compared with normal group C,1)P<0.05;compared with POF group,2)P<0.05.

圖3 C3在各組大鼠卵巢中的表達(dá)Fig.3 Expression of C3 in ovarian tissue of rats in each groupNote: Compared with normal group,*.P<0.05；compared with POF group，#.P<0.05.

圖4 CYP51在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)(×200)Fig.4 Expression of CYP51 in ovarian tissue of rats in each group(×200)

GroupsnExpression of CYP51F valueP valueNormal83.60±0.5524.7530.000POF83.76±0.821)PTH86.66±0.712)PTM84.63±1.30PTL84.51±1.33

Note：Compared with normal group,1)P<0.05;compared with POF group,2)P<0.05.

圖5 CYP51在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of CYP51 in ovarian tissue of rats in each groupNote: Compared with normal group,*.P<0.05；compared with POF group，#.P<0.05.

3 討論

由于POF病因復(fù)雜多樣尚未明確，目前尚沒有有效的治療方法及措施，治療困難。在POF的治療方式上，西醫(yī)多采用激素替代療法(Hormone replacement therapy，HRT)和促排卵療法，即給予相應(yīng)激素以補充機體雌激素不足達(dá)到治療目的等[7]。但是HRT療法具有療程長、毒副作用強等特點,在治療的同時會增加患者患心臟病、子宮內(nèi)膜癌等惡性疾病的風(fēng)險。對于POF,中藥木尼孜其合劑專為慢性應(yīng)激(環(huán)境)所造成的生殖疾病設(shè)計，其原理為調(diào)節(jié)改善人體微環(huán)境從而調(diào)節(jié)人體動態(tài)平衡。此方法相對于西醫(yī)的HRT等療法療效顯著、副作用小。

C3是補體系統(tǒng)的核心。它在補體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用。目前尚未有文獻(xiàn)報道POF與C3間的關(guān)系，但有文獻(xiàn)報道，多囊卵巢綜合征患者C3水平與代謝綜合征患者有密切聯(lián)系。作為炎性因子的補體C3，是多囊卵巢綜合征患者出現(xiàn)代謝缺陷的獨立危險因子[8]。有研究表明[9]，C3和胰島素抵抗與多囊卵巢綜合征有一定的聯(lián)系，除此之外，C3除了在肝臟合成外，還像其他急性期蛋白一樣，同樣也能由被激活的巨噬細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分泌，故被稱為炎性細(xì)胞因子和脂肪因子[10]。本研究測定在卵巢組織中C3蛋白的表達(dá)，免疫組化結(jié)果顯示，POF模型組大鼠卵巢C3蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別升高了154.17%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過中醫(yī)民藥木尼孜其合劑藥物干預(yù)之后，POF藥物干預(yù)高劑量組與中劑量組能夠顯著降低C3蛋白含量水平(P<0.05)。提示在長期的濕寒環(huán)境中，隨著內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂，大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)也可能出現(xiàn)紊亂情況并且伴隨著炎性反應(yīng)的發(fā)生，中藥木尼孜其合劑可能通過調(diào)節(jié)其免疫系統(tǒng)，有效抑制炎性反應(yīng)，從而起到改善卵巢相關(guān)炎癥的作用。

甾醇14-去甲基化酶(CYP51)是生物甾醇合成過程中的一個關(guān)鍵酶,屬于細(xì)胞色素P450超家族[11]。CYP51作為生物甾醇如膽固醇合成中的關(guān)鍵酶，可以把甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成FF-MAS。而FF-MAS是一種促性腺激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的重要信號分子，能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂[12]。本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CYP51蛋白在大鼠卵巢黃體，間質(zhì)以及在卵泡膜上表達(dá)，這與Yamashita等[13]的研究相符合。結(jié)果顯示，POF模型組大鼠卵巢CYP51蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別下降了57.22%，經(jīng)過統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過中藥木尼孜其合劑藥物干預(yù)作用，POF藥物干預(yù)高劑量組能夠顯著升高CYP51蛋白在卵巢中的表達(dá)。提示，POF的發(fā)生可能隨著CYP51蛋白表達(dá)的減少影響各細(xì)胞膜的形成，進(jìn)一步影響細(xì)胞發(fā)育。此外CYP51的減少可能影響FF-MAS的形成，進(jìn)一步影響卵母細(xì)胞的分裂。中藥木尼孜其合劑可能通過有效調(diào)節(jié)CYP51的表達(dá)，從而有效改善卵巢內(nèi)各級卵泡的成熟發(fā)育，起到改善卵巢功能的作用。