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        慢性應(yīng)激致卵巢早衰大鼠C3與CYP51蛋白表達(dá)水平比較①

        2019-03-11 10:16:22阿卜力孜克熱木納菲沙卡德爾穆拉迪力約麥爾阿孜古麗要力瓦斯瑪依熱吐爾哄夏米西努爾伊力克
        中國免疫學(xué)雜志 2019年4期
        關(guān)鍵詞:甾醇卵母細(xì)胞合劑

        阿卜力孜·克熱木 納菲沙·卡德爾 穆拉迪力·約麥爾 阿孜古麗·要力瓦斯 瑪依熱·吐爾哄 夏米西努爾·伊力克

        (新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室,烏魯木齊830054)

        卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指婦女在40 歲之前由于各種原因出現(xiàn)持續(xù)性閉經(jīng),除 此之外還伴有卵泡刺激素(Follicle stimulating hormone,FSH)及促黃體生成素(Luteinizing horm-one,LH)升高,而雌二醇(Estrogen,E2)降低的綜合征[1-4]。機體在遇到各種不利的刺激后,會通過調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)而產(chǎn)生一系列反應(yīng),謂之應(yīng)激。與應(yīng)激相關(guān)的臨床疾病并不罕見,在生殖內(nèi)分泌疾病如月經(jīng)失調(diào)、無排卵月經(jīng)、閉經(jīng)、不孕、性功能障礙等,慢性應(yīng)激已經(jīng)成為重要的致病因素[5,6]。前期研究通過分析POF大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的形態(tài)學(xué)變化,通過Masson染色及HE染色觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化,初步確認(rèn)POF大鼠的組織形態(tài)學(xué)病因,通過中藥木尼孜其合劑的藥物干預(yù)作用,確認(rèn)其在POF大鼠中對性腺軸的改善作用[1]。本研究在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上研究卵巢炎癥及卵泡發(fā)育成熟有關(guān)蛋白,C3是補體系統(tǒng)的核心,它是啟動補體活化旁路途徑并參與其級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子。CYP51作為生物甾醇合成中的關(guān)鍵酶,可以把甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成 FF-MAS。而FF-MAS是一種促性腺激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的重要信號分子,能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。前期研究通過分析POF大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸的形態(tài)學(xué)變化,通過Masson染色及HE染色觀察各組大鼠卵巢形態(tài)學(xué)變化,初步確認(rèn)POF大鼠的組織形態(tài)學(xué)病因,通過中藥木尼孜其合劑的藥物干預(yù)作用,確認(rèn)其在POF大鼠中對性腺軸的改善作用。本研究在形態(tài)學(xué)的基礎(chǔ)上研究卵巢炎癥及卵泡發(fā)育成熟的有關(guān)蛋白,C3是補體系統(tǒng)的核心,它是啟動補體活化旁路途徑并參與其級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵分子。CYP51作為生物甾醇合成中的關(guān)鍵酶,可以把甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成FF-MAS。而FF-MAS是一種促性腺激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的重要信號分子,能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1實驗動物及其分組 通過陰道涂片實驗篩選出清潔級兩月齡左右的性成熟雌性Wistar大鼠90只,平均體質(zhì)量為230~250 g,實驗動物由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周之后,開始進(jìn)行造模。隨機抽取10只為正常對照組(C組),其余80只為造模組。

        1.1.2主要試劑及儀器 (RXZ型)人工氣候箱(寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司);ZBY-149-83型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);臺式高速離心機HC-16(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);兔多克隆抗體CYP51、兔單克隆抗體C3(美國Abcam公司);菠菜實、芫荽籽,JEM-1230型透射式電子顯微鏡(日本電子&美國GATAN);徠卡DM3000數(shù)碼顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)。

        1.2方法

        1.2.1慢性應(yīng)激致POF大鼠模型的建立 模型大鼠置于人工氣候箱中飼養(yǎng),溫度為(6±1)℃,濕度為(85±5)%,每日北京時間10:00至20:00放入。在濕寒環(huán)境下飼養(yǎng)。在造模過程中,C組每日給予常規(guī)飼料500 g,飲用水500 ml以及木屑墊料150 g。慢性應(yīng)激模型組每日給予濕寒屬性飼料500 g,飲用水及墊料給予量與正常組一致。正常組與慢性應(yīng)激模型組均隨機飲食水,每周選擇同一固定時間點觀測并記錄生物學(xué)表征如體重、進(jìn)食量、飲水量、尿量以及大便量等并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析[1]。

        1.2.2正常對照組 常規(guī)環(huán)境(溫度:20℃±2℃,濕度:55%~65%)中飼養(yǎng),每日隨機飲食水。模型組與正常對照組進(jìn)行每日12 h人工照明,并定時觀測各組大鼠生物學(xué)表征的變化。

        1.2.3應(yīng)激組及POF組大鼠的分組及藥物干預(yù) 建立慢性應(yīng)激動物模型,從大鼠眼眶靜脈叢進(jìn)行采血并通過放射免疫法檢測外周血清中E2、LH及FSH的激素含量,慢性應(yīng)激模型組各大鼠激素含量與正常組大鼠激素含量做比較,并結(jié)合慢性應(yīng)激組各大鼠發(fā)情周期的變化篩選出POF模型動物,將其隨機分為POF模型組(P組)、POF藥物干預(yù)高劑量組(PTH組)、POF藥物干預(yù)中劑量組(PTM組)、POF藥物干預(yù)低劑量組(PTL組);未成POF的慢性應(yīng)激模型動物隨機分為應(yīng)激模型組(S組)、應(yīng)激藥物干預(yù)高劑量組(STH組)、應(yīng)激藥物干預(yù)中劑量組(STM組)、應(yīng)激藥物干預(yù)低劑量組(STL組)。應(yīng)激模型組及應(yīng)激藥物干預(yù)組共48只大鼠,用于其他實驗研究。上述藥物干預(yù)組動物用中藥木尼孜其合劑分高、中、低三種劑量灌胃,藥物干預(yù)時間為2周。在藥物干預(yù)期間每3 d進(jìn)行生物學(xué)表征的觀察與記錄,最后與正常組大鼠進(jìn)行比較分析。

        1.2.4觀察指標(biāo) 給藥結(jié)束后將所有大鼠采用10% 水合氯醛,按照所稱體重3 ml/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉,速取大鼠卵巢組織,卵巢組織用4%多聚甲醛溶液進(jìn)行固定,隨后進(jìn)行石蠟包埋切片,卵巢組織切片采用免疫組織化學(xué)的方法檢測大鼠卵巢組織中C3與CYP51蛋白的表達(dá)。

        1.2.5免疫組織化學(xué)方法 每個樣本隨機選取10個視野并保證各視野之間完全不重疊,采用陽性細(xì)胞計數(shù)法,每組一般為7~10個不同樣本,隨后進(jìn)行組間比較。評分方法通過陽性范圍和著色強度兩方面進(jìn)行。其中陽性范圍是指陽性細(xì)胞所占的百分率,分為5個等級,即0(<5%)、1(6%~25%)、2(26%~50%)、3(51%~75%)、4(>75%);著色強度是指陽性細(xì)胞染色的深淺程度,分為4個等級,即0(幾乎不著色或者有一點著色)、1(著色但比較淺)、2(著色且比較深)、3(著色非常深);最終結(jié)果為陽性范圍×著色強度×25。

        2 結(jié)果

        2.1卵巢電鏡結(jié)果 為了觀察卵巢組織超微結(jié)構(gòu)的變化,用戊二醛固定之后切片在電鏡下進(jìn)行觀察,如圖1所示,正常組大鼠顆粒細(xì)胞核清晰,核仁清晰,線粒體豐富,可見少量溶酶體,偶見線粒體輕微腫脹;POF組大鼠細(xì)胞基質(zhì)溶解,細(xì)胞核膜溶解,核仁結(jié)構(gòu)不清晰,線粒體溶解,細(xì)胞不完整,出現(xiàn)大量纖維彌漫性增生; PTH組大鼠出現(xiàn)異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象,細(xì)胞核清晰可見,核仁清晰,顆粒細(xì)胞形體正常,細(xì)胞間隙比較致密;PTM組大鼠線粒體輕微腫脹,吞飲泡較多,細(xì)胞核外形較規(guī)則;PTL組大鼠吞飲泡多,基質(zhì)壞死較嚴(yán)重,細(xì)胞核固縮,線粒體收縮等。

        2.2C3的表達(dá) 如圖2所示,C3蛋白在各組卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá),間質(zhì)以及在黃體中不表達(dá)或低表達(dá),C3蛋白主要在正常組大鼠卵巢顆粒層細(xì)胞中表達(dá),黃體中少量表達(dá);在POF組中大鼠顆粒層細(xì)胞、黃體及間質(zhì)中高度表達(dá);經(jīng)過藥物干預(yù)C3蛋白在各組卵巢中的表達(dá)呈不同程度下降趨勢。如表1、圖3所示,POF組大鼠卵巢C3蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別升高了154.17%。經(jīng)過統(tǒng)計分析其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PTH組、PTM組、PTL組大鼠卵巢C3蛋白表達(dá)較POF組大鼠分別降低了13.22%、12.57%、8.19%,其中PTH組、PTM組與POF組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與PTL組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        圖1 各組大鼠卵巢電鏡圖Fig.1 Ovarian sections of each group rats under electron microscope

        圖2 C3在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)(×200)Fig.2 Expression of C3 in ovarian tissue of rats in each group(×200)

        2.3CYP51的表達(dá) 如圖4所示,CYP51蛋白在各組卵巢間質(zhì)以及在黃體中高表達(dá),在卵泡顆粒層細(xì)胞中不表達(dá),CYP51在正常組大鼠黃體及在間質(zhì)中高表達(dá),顆粒層細(xì)胞中不表達(dá),其在POF組大鼠中的表達(dá)明顯下降,經(jīng)過藥物干預(yù),在各劑量藥物干預(yù)組中不同程度的升高。如表2、圖5所示,POF組大鼠卵巢CYP51蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別下降了57.22%、46.08%,其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);PTH組、PTM組、PTL組大鼠卵巢CYP51蛋白表達(dá)較POF組大鼠分別升高了77.13%、23.14%、19.95%,其中PTH組與POF組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),PTL組、PTM組與POF組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        GroupsnExpression of C3F valueP valueNormal83.60±0.5526.1530.000POF89.15±0.971)PTH87.94±0.692)PTM88.00±1.042)PTL88.40±0.68

        Note:Compared with normal group C,1)P<0.05;compared with POF group,2)P<0.05.

        圖3 C3在各組大鼠卵巢中的表達(dá)Fig.3 Expression of C3 in ovarian tissue of rats in each groupNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with POF group,#.P<0.05.

        圖4 CYP51在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)(×200)Fig.4 Expression of CYP51 in ovarian tissue of rats in each group(×200)

        GroupsnExpression of CYP51F valueP valueNormal83.60±0.5524.7530.000POF83.76±0.821)PTH86.66±0.712)PTM84.63±1.30PTL84.51±1.33

        Note:Compared with normal group,1)P<0.05;compared with POF group,2)P<0.05.

        圖5 CYP51在各組大鼠卵巢組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of CYP51 in ovarian tissue of rats in each groupNote: Compared with normal group,*.P<0.05;compared with POF group,#.P<0.05.

        3 討論

        由于POF病因復(fù)雜多樣尚未明確,目前尚沒有有效的治療方法及措施,治療困難。在POF的治療方式上,西醫(yī)多采用激素替代療法(Hormone replacement therapy,HRT)和促排卵療法,即給予相應(yīng)激素以補充機體雌激素不足達(dá)到治療目的等[7]。但是HRT療法具有療程長、毒副作用強等特點,在治療的同時會增加患者患心臟病、子宮內(nèi)膜癌等惡性疾病的風(fēng)險。對于POF,中藥木尼孜其合劑專為慢性應(yīng)激(環(huán)境)所造成的生殖疾病設(shè)計,其原理為調(diào)節(jié)改善人體微環(huán)境從而調(diào)節(jié)人體動態(tài)平衡。此方法相對于西醫(yī)的HRT等療法療效顯著、副作用小。

        C3是補體系統(tǒng)的核心。它在補體經(jīng)典激活途徑和旁路激活途徑中均發(fā)揮重要作用。目前尚未有文獻(xiàn)報道POF與C3間的關(guān)系,但有文獻(xiàn)報道,多囊卵巢綜合征患者C3水平與代謝綜合征患者有密切聯(lián)系。作為炎性因子的補體C3,是多囊卵巢綜合征患者出現(xiàn)代謝缺陷的獨立危險因子[8]。有研究表明[9],C3和胰島素抵抗與多囊卵巢綜合征有一定的聯(lián)系,除此之外,C3除了在肝臟合成外,還像其他急性期蛋白一樣,同樣也能由被激活的巨噬細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分泌,故被稱為炎性細(xì)胞因子和脂肪因子[10]。本研究測定在卵巢組織中C3蛋白的表達(dá),免疫組化結(jié)果顯示,POF模型組大鼠卵巢C3蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別升高了154.17%,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)過中醫(yī)民藥木尼孜其合劑藥物干預(yù)之后,POF藥物干預(yù)高劑量組與中劑量組能夠顯著降低C3蛋白含量水平(P<0.05)。提示在長期的濕寒環(huán)境中,隨著內(nèi)分泌系統(tǒng)的紊亂,大鼠體內(nèi)免疫系統(tǒng)也可能出現(xiàn)紊亂情況并且伴隨著炎性反應(yīng)的發(fā)生,中藥木尼孜其合劑可能通過調(diào)節(jié)其免疫系統(tǒng),有效抑制炎性反應(yīng),從而起到改善卵巢相關(guān)炎癥的作用。

        甾醇14-去甲基化酶(CYP51)是生物甾醇合成過程中的一個關(guān)鍵酶,屬于細(xì)胞色素P450超家族[11]。CYP51作為生物甾醇如膽固醇合成中的關(guān)鍵酶,可以把甾醇類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成FF-MAS。而FF-MAS是一種促性腺激素誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過程中的重要信號分子,能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂[12]。本研究免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),CYP51蛋白在大鼠卵巢黃體,間質(zhì)以及在卵泡膜上表達(dá),這與Yamashita等[13]的研究相符合。結(jié)果顯示,POF模型組大鼠卵巢CYP51蛋白表達(dá)較正常組大鼠分別下降了57.22%,經(jīng)過統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)過中藥木尼孜其合劑藥物干預(yù)作用,POF藥物干預(yù)高劑量組能夠顯著升高CYP51蛋白在卵巢中的表達(dá)。提示,POF的發(fā)生可能隨著CYP51蛋白表達(dá)的減少影響各細(xì)胞膜的形成,進(jìn)一步影響細(xì)胞發(fā)育。此外CYP51的減少可能影響FF-MAS的形成,進(jìn)一步影響卵母細(xì)胞的分裂。中藥木尼孜其合劑可能通過有效調(diào)節(jié)CYP51的表達(dá),從而有效改善卵巢內(nèi)各級卵泡的成熟發(fā)育,起到改善卵巢功能的作用。

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