劉劍 易路遙 晏亮 吉偉佳 虞雪軍

文章提出利用一維反相高效液相色譜法測(cè)定片劑、顆粒、軟膠囊和硬膠囊保健食品中維生素D的含量。方法：樣品經(jīng)淀粉酶水解，其中加入抗氧化劑；水解后加入氫氧化鉀皂化，再用石油醚提取，經(jīng)氮吹至近干，用甲醇溶解搖勻。經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后供液相色譜儀分析。以Thermo Accucore Polar Premium（100mm*4.6 mm）為分離柱，甲醇-乙腈為流動(dòng)相，流速為0.8ml/min，進(jìn)樣量為20μL，在DAD波長(zhǎng)264nm處作檢測(cè)。檢出限為0.7μg/100g，方法中維生素D2平均回收率為93.7%- 98.8% ；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.5%- 5.6%；維生素D3平均回收率為92.8%- 99.1% ；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%- 6.7 %。該方法快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，適用于片劑、顆粒、軟膠囊和硬膠囊保健食品中維生素D測(cè)定。

試驗(yàn)部分

儀器與試劑。高效液相色譜儀（美國(guó)，型號(hào)Ultimate），電子天平（美國(guó)，型號(hào)XS205DU）、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本，型號(hào)U- 3900），氮吹儀（美國(guó)Orgnomation公司）。

維生素D2（中國(guó)食品藥品檢定研究院）標(biāo)準(zhǔn)品和維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品鑒定所）。乙腈、甲醇、2，6-二叔丁基對(duì)甲酚、無(wú)水乙醇均為色譜純；石油醚、抗壞血酸、氫氧化鉀為分析純；α-淀粉酶活力300U/mg。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的制備：精密稱(chēng)取維生素D2標(biāo)準(zhǔn)品11.86mg，置50mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱(chēng)取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)品12.09mg，置50mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；于4℃條件下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度的校正：精密吸取維生素D2和D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各500μl于各10ml棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度，混勻，分別用1cm比色皿中，以無(wú)水乙醇為空白參比，在264nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，得維生素D2儲(chǔ)備液濃度為222.4μg/ml和維生素D3儲(chǔ)備液濃度為236.8μg/ml。

樣品制備。1.酶解：稱(chēng)取混合均勻試樣約5g，置250mL三角燒瓶中，加入20ml50℃的水，加入0.01ml單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液作為內(nèi)標(biāo)（如測(cè)定維生素D2時(shí)，把維生素D3作內(nèi)標(biāo)；如測(cè)定維生素D3時(shí)，把維生素D2作內(nèi)標(biāo)；）1.0gα-淀粉酶，置于60℃恒溫水浴振蕩30min。2.皂化：于酶解液中加1.0g抗壞血酸和0.1g2，6-二叔丁基對(duì)甲酚，混勻。加入30ml無(wú)水乙醇，20ml氫氧化鉀溶液（250g氫氧化鉀加入250ml水中，冷卻后貯存于聚乙烯容器中，臨用現(xiàn)配），邊加邊振搖，混勻后于恒溫磁力攪拌器上80℃回流皂化30min，皂化后立即用冷水冷卻至室溫。3.提?。簩⒃砘河?0ml水轉(zhuǎn)入250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚，振蕩提取5min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250ml分液漏斗中，加入50ml石油醚再次提取，合并醚層。用150ml水洗滌醚層，重復(fù)4次，將醚層洗至中性，去除下層水相。將洗滌后的醚層于250ml旋轉(zhuǎn)蒸餾瓶中，氮吹至干，用甲醇溶解殘?jiān)⒍ㄈ葜?0ml，經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。

儀器工作條件。色譜柱：T he rm o Accucore Polar Premium（100mm*4.6 mm） ，柱溫：30℃；DAD檢測(cè)波長(zhǎng)264nm；流速：0.8ml/min；進(jìn)樣量：20μl；流動(dòng)相：A：乙腈，B甲醇：；梯度洗脫程序：0～8.0min，0%～40%B；8.0～15.0min，40%B；15.0～16.0min，40%～0%B；16～20min，0%B。

結(jié)果與討論

樣品制備方法的選擇。為使維生素D2、維生素D3得到良好的提取效果，試驗(yàn)中還采用了甲醇和乙腈直接提取的處理方法。如下：取2.5g樣品置25ml容量瓶中，分別加入甲醇和乙腈溶液，超聲30min，冷卻至室溫，分別用甲醇和乙腈定容，搖勻；經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾。經(jīng)儀器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以上兩種處理方法出效果不佳，樣品量遠(yuǎn)遠(yuǎn)未得到有效提取，得不到理想的處理效果；采用先酶解，在皂化，最后提取的處理方法能有效檢測(cè)樣品中的維生素D的含量。試驗(yàn)選擇酶解，在皂化，最后提取的處理方法。

流動(dòng)相的選擇。試驗(yàn)采用了甲醇、乙腈、甲醇-水（50+50）、乙腈-水（50+50）和甲醇-乙腈（梯度洗脫程序：0～8.0min，0%～40% B；8.0～15.0min，40% B；15.0～16.0min，40%～0% B；16～20min，0% B。）為流動(dòng)相，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用甲醇-乙腈（梯度洗脫）使維生素D2和維生素D3良好的分離效果，分離度在2.0以上，符合檢測(cè)要求，試驗(yàn)選擇甲醇-乙腈（梯度洗脫程序：0～8.0min，0%～40% B；8.0～15.0min，40%B；15.0～16.0min，40%～0%B；16～20min，0%B。）為流動(dòng)相。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限。精密吸取維生素D2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml于100ml棕色容量瓶中，分別加入0.1ml維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液作為內(nèi)標(biāo)，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得維生素D2系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。精密吸取維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各0ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml、2ml于100ml棕色容量瓶中，分別加入0.1ml維生素D2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液作為內(nèi)標(biāo)，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得維生素D3系列標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液。精密吸取系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20μl注入液相色譜儀檢測(cè)，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)濃度為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明，維生素D2、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系；

維生素D2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：

y=0.4136x- 0.0026，R2=0.9999；

維生素D3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：

y=0.6176x- 0.0049，R2=0.9999。

按所建立的色譜條件，以3倍噪音比作為本方法檢出限、10倍信噪比為定量限，測(cè)得維生素D2、維生素D3的檢出限均可以達(dá)到 0.7μg/100g，定量限均可以達(dá)到2μg/100g。維生素D2、維生素D3色譜圖見(jiàn)圖1。

方法的回收率和精密度。分別在片劑、顆粒、軟膠囊和硬膠囊保健食品中添加維生素D2、維生素D3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，考察方法的回收率。每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6次，考察方法的精密度，結(jié)果樣品的維生素D2平均回收率為93.7% -98.8% ；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.5%- 5.6 %；樣品的維生素D3平均回收率為92.8%- 99.1% ；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差0.3%- 6.7 %；方法準(zhǔn)確度及精密度滿(mǎn)足要求。

本法將片劑、顆粒、軟膠囊和硬膠囊保健品樣品，經(jīng)酶解、皂化、提取后，采用一維反相液相色譜條件下檢測(cè)，得到良好的分離。本法前處理簡(jiǎn)單，分離度好，回收率高，分析速度快，精密度好，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。能夠用于片劑、顆粒、軟膠囊和硬膠囊保健食品中的維生素D測(cè)定。

作者簡(jiǎn)介：

劉劍（1990-），男，本科學(xué)歷，助理工程師，主要從事食品藥品化妝品檢驗(yàn)研究。通訊作者：易路遙（1983-），女，碩士學(xué)歷，質(zhì)量高級(jí)工程師，主要從事食品藥品化妝品檢驗(yàn)研究。