陳美瑜,林竹光

(1.廈門大學(xué) 材料學(xué)院，高性能陶瓷纖維教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)系，福建 廈門 361005)

隨著人們生活水平和保健意識的提升，牛奶作為補(bǔ)鈣的最佳途徑之一備受歡迎。牛奶在食物營養(yǎng)鏈中處于較高級，其含有的農(nóng)藥殘留量相對較高，長期食用被農(nóng)藥污染的牛奶能致畸、致癌、致突變，對人體健康危害較大[1]。因此，建立一種準(zhǔn)確、靈敏的分析方法來監(jiān)測牛奶中的農(nóng)藥殘留十分必要。測定牛奶中農(nóng)藥殘留常用的分析方法有氣相色譜法[2-3]、液相色譜法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜法[5-6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7-8]、液相色譜-質(zhì)譜法[9-10]等。其中串聯(lián)質(zhì)譜法以“時間串聯(lián)”質(zhì)譜的方式，使用二級質(zhì)譜技術(shù)選擇適合的母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，排除了背景與基質(zhì)干擾，具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高且成本低廉的特點(diǎn)，已在環(huán)境[11-12]和生物[13-15]分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

本文在前期研究基礎(chǔ)上[16]，建立了GC-IT-MS/MS同時測定牛奶中32種農(nóng)藥殘留的分析方法。本方法操作簡單、抗干擾能力強(qiáng)，適用于目標(biāo)化合物含量低、基質(zhì)背景復(fù)雜的牛奶樣品分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Varian Saturn 2100T GC/MS/MS系統(tǒng)，配備3900氣相色譜和EI與CI兩種電離源；KQ 3200E超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；自制的氮吹濃縮裝置。

乙腈、正己烷、丙酮(農(nóng)殘級，美國Tedia公司)；中性氧化鋁(200～300目)、無水Na2SO4(分析純，國藥集團(tuán)股份有限公司)；滅線磷、甲拌磷、二嗪磷、乙拌磷、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、皮蠅磷、殺螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷、溴硫磷、乙硫磷、α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、艾氏劑、環(huán)氧七氯、狄氏劑、異狄氏劑、p,p’-DDE、p,p’-DDD、p,p’-DDT、聯(lián)苯菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯(中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所)；氟氯氰菊酯、內(nèi)標(biāo)物PCB 103(美國Accu Standard Inc.)。

1.2 GC-MS/MS分析條件

GC分析條件：HP-5 MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm)；He載氣(>99.999%)；載氣流速：1.00 mL/min；不分流進(jìn)樣1.00 μL(均采用自動進(jìn)樣器)；進(jìn)樣口260 ℃。色譜柱升溫程序：從80 ℃ 以25 ℃/min升至250 ℃，然后以2 ℃/min升至260 ℃，并保持15 min。

MS/MS分析條件：阱溫200 ℃；阱外套40 ℃；傳輸線280 ℃；電子倍增管電壓1 550 V；電子倍增管增益電壓200 V；電離能量70 eV；CI采用甲醇作為反應(yīng)氣；所有化合物均采用共振激活裂解方式。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：將13種有機(jī)磷農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液用丙酮稀釋成10.0 mg/L的儲備液，將11種有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液、8種擬除蟲菊酯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)物用正己烷稀釋成10.0 mg/L的儲備液，于4 ℃保存,有效期1年。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量32種農(nóng)藥儲備液，用正己烷-丙酮(1∶1，體積比)稀釋成32種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中有機(jī)磷類和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、500 μg/L，有機(jī)氯類農(nóng)藥的質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200 μg/L，內(nèi)標(biāo)物PCB 103的質(zhì)量濃度為10 μg/L。

1.4 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取3.0 g牛奶于100 mL錐形瓶中，加入3.0 g 200～300目的中性氧化鋁及適量的無水硫酸鈉，充分?jǐn)噭蛑涟霛駹顟B(tài)。以15.0 mL乙腈超聲提取15 min，提取液經(jīng)快速定量濾紙過濾；殘渣再用10.0 mL乙腈超聲提取10 min，過濾后合并2次濾液，置于50 ℃恒溫水浴中氮吹濃縮至干，用正己烷-丙酮(1∶1)將其溶解并轉(zhuǎn)移至帶刻度的2.0 mL測試瓶，加入0.4 mL 25 μg/L PCB 103(IS)，定容至1.0 mL，待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件

前處理方法參照本課題組的前期研究成果[16]，采用改進(jìn)的基質(zhì)固相分散方法，用乙腈作為提取劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，32種農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為71.5%～116%，方法的回收率能滿足痕量農(nóng)藥殘留的分析要求。

2.2 色譜升溫程序

色譜柱升溫程序的設(shè)定，原則上既要保證目標(biāo)物的完全分離，又要盡量縮短分析時間。但多農(nóng)殘分析對色譜柱的要求極高，且每個目標(biāo)物均設(shè)定一個流出時間段，將使分析時間過長，不利于多殘留的分析。GC-MS/MS對于多殘留分析中無法完全分離的目標(biāo)物，提供了多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的方式，可同時開設(shè)5個不同的離子通道，運(yùn)用不同的MS/MS分析條件在同一時間段對5種不同目標(biāo)物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。32種農(nóng)藥的分離時間見表1。

表1 32種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)物的MS/MS質(zhì)譜參數(shù)Table 1 GC-IT-MS/MS parameters for 32 pesticides and internal standard

*quantitation ion

2.3 MS/MS條件的優(yōu)選

在離子阱中，高濃度的目標(biāo)物可能會使質(zhì)譜譜圖變形，且高濃度目標(biāo)物優(yōu)化后的MS/MS條件不一定適合于低濃度同種目標(biāo)物的分析，因而在確定MS/MS分析條件時，選擇中等濃度的32種混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(200 μg/L，其中有機(jī)氯農(nóng)藥為100 μg/L)優(yōu)化MS/MS分析條件。

圖1 32種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖

圖2 乙硫磷在不同阱溫下的GC-MS/MS譜圖

圖3 滅線磷在不同總離子數(shù)下的GC-MS/MS譜圖

2.3.1母離子的選擇MS/MS分析包括兩個過程：母離子的選擇和子離子的形成。目標(biāo)物或內(nèi)標(biāo)物進(jìn)入離子阱，被解離為離子碎片，選擇豐度高、質(zhì)荷比大的離子作為母離子。采用合適的碰撞能量使母離子解離，再選擇合適的子離子進(jìn)行定量分析。圖1為GC-MS/MS分析32種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖(TIC) 。從圖中可以看出，采用GC-MS/MS進(jìn)行分析時，樣品基質(zhì)和柱流失的干擾小，農(nóng)藥的分析靈敏度較高。

2.3.2共振分析的碰撞誘導(dǎo)解離電壓離子阱中母離子裂解的方式包括共振裂解和非共振裂解。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)采用非共振裂解方式時母離子裂解的能力較弱，本實(shí)驗(yàn)在共振裂解方式下優(yōu)選碰撞誘導(dǎo)解離(CID)電壓。結(jié)果表明，當(dāng)CID電壓大于1 V時，大多數(shù)目標(biāo)物被裂解為質(zhì)荷比較低的子離子，因而CID電壓選擇0～1 V。合適的CID電壓應(yīng)使MS/MS譜圖中保有適量的母離子及合適豐度的子離子。32種目標(biāo)物的CID電壓優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.3.3離子阱溫度的選擇離子阱在低溫時對極性較弱的目標(biāo)物或干擾物的離子具有吸附作用并阻礙離子從離子阱中拋出。由圖2可知，當(dāng)阱溫為180 ℃時，乙硫磷的GC-MS/MS色譜峰有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象；當(dāng)阱溫升至200 ℃時，峰拖尾現(xiàn)象明顯改善；當(dāng)阱溫為220 ℃時，離子流強(qiáng)度值下降，原因可能是高溫使離子碎片部分裂解。因此，本文采用200 ℃作為離子阱的分析溫度。

2.3.4離子源和反應(yīng)氣總離子數(shù)的選擇化學(xué)電離(CI)源是通過在反應(yīng)過程中引入反應(yīng)氣，燈絲發(fā)出的電子先將反應(yīng)氣電離，然后反應(yīng)氣離子與樣品分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使目標(biāo)物形成多1個氫離子的準(zhǔn)分子離子。CI源的應(yīng)用使得MS/MS法可以分析一些分子量較小或穩(wěn)定性較差的不適于EI源分析的化合物。32種農(nóng)藥的離子源方式見表1，除穩(wěn)定性較差的滅線磷、乙拌磷、甲基毒死蜱、甲基對硫磷、殺螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、對硫磷和氟氯氰菊酯使用CI源以外，其余的23種農(nóng)藥均采用EI源。

本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為CI的反應(yīng)氣并優(yōu)化其總離子數(shù)。圖3是滅線磷在不同離子數(shù)下的GC-CI-MS/MS譜圖，從圖中可以看出，當(dāng)離子數(shù)較低(675 counts)時，峰響應(yīng)值較低，信噪比低；當(dāng)離子數(shù)較高(1 275 counts)時，峰響應(yīng)值雖高，但背景響應(yīng)值也升高，使信噪比較低。而選擇875 counts作為反應(yīng)氣的總離子數(shù)，可使分析的信噪比最高，且能達(dá)到較理想的分析結(jié)果。

2.3.5其他MS/MS參數(shù)由于離子化時間越長，目標(biāo)物的離子化程度越充分，分析的靈敏度越高，故本實(shí)驗(yàn)采用最大離子化時間25 ms(EI)、2 000 μs(CI)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其余參數(shù)對分析靈敏度的影響不大，故采用儀器的缺省值：預(yù)掃描時間1 500 μs(EI)，100 μs(CI)；離子阱離子濃度AGC目標(biāo)值為5 000；離子分離窗口m/z為5。

2.4 線性關(guān)系及方法檢出限

在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件下分別采集“1.3”配制的不同濃度32種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)物的GC-MS/MS色譜圖，分別以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物定量離子的峰面積比(y)對目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的濃度比(x)作線性分析，得到的線性范圍和相關(guān)系數(shù)(r)見表2。結(jié)果表明,32種農(nóng)藥在測試濃度范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.994。

按取樣量1.00 g 、定容體積 1.00 mL 、 進(jìn)樣體積 1.00 μL和信噪比S/N≥3計算，得到各農(nóng)藥的方法檢出限(MDL)見表2。結(jié)果表明,除倍硫磷和毒死蜱的MDL分別為1.7、2.8 μg/kg，其它30種農(nóng)藥的MDL為0.026～1.2 μg/kg。

表2 32種農(nóng)藥和內(nèi)標(biāo)物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(MDL)、平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r),method detection limits(MDL)，mean recoveries and RSDs for 32 pesticides and internal standard

2.5 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

稱取3.0 g牛奶空白樣品(32種農(nóng)藥殘留均小于MDL)分別添加相當(dāng)于牛奶樣品含50、200 μg/kg濃度水平的32種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(有機(jī)氯類農(nóng)藥的加標(biāo)濃度水平分別為20、100 μg/kg)，按實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行分析(n=5)，各農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表2。從表中可以看出，各農(nóng)藥的平均加標(biāo)回收率為71.5%～116%，RSD為1.9%～14%。方法的準(zhǔn)確度與精密度符合痕量農(nóng)藥殘留的分析要求。

2.6 方法的選擇性

采用裂解母離子產(chǎn)生的特征子離子對目標(biāo)物進(jìn)行定性與定量分析，不易受基體的干擾，因而GC-MS/MS分析結(jié)果靈敏度和可靠性更高。圖4A、B分別為100 μg/L毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液和加標(biāo)100 μg/L毒死蜱的牛奶提取液的MS/MS譜圖，兩圖無明顯差別，可看出該方法消除基體干擾的能力極強(qiáng)，基本不出現(xiàn)基體背景產(chǎn)生的干擾信號。

2.7 實(shí)際樣品的檢測

將本方法應(yīng)用于多種品牌10個牛奶樣品的分析(樣品購于當(dāng)?shù)卮笮统?，在純牛奶和花生牛奶中檢出p,p’-DDT、氯氰菊酯和氰戊菊酯，其含量分別為5.1～18.6 μg/kg、5.9～15.1 μg/kg和4.8～9.8 μg/kg，均低于GB2763-2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定的最大殘留限量[17]。

3 結(jié) 論

本文建立了GC-IT-MS/MS同時測定牛奶中32種農(nóng)藥的分析方法，并系統(tǒng)研究了離子阱串聯(lián)質(zhì)譜參數(shù)對目標(biāo)化合物檢測結(jié)果的影響。通過優(yōu)化母離子和子離子、CID電壓、離子源溫度、EI/CI電離源、反應(yīng)氣的總離子數(shù)、離子化時間、預(yù)掃描時間、AGC目標(biāo)值、離子分離窗口，確定了最佳質(zhì)譜條件。該方法無需凈化處理、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度高、選擇性好，方法檢出限為0.026～2.8 μg/kg，實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為71.5%～116%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～14%，可滿足脂肪含量高、基體復(fù)雜的牛奶中痕量農(nóng)藥多殘留的快速檢測。