張若鵬，康天放，魯理平，程水源

(北京工業(yè)大學 區(qū)域大氣復合污染防治北京市重點實驗室，環(huán)境與能源工程學院，北京 100124)

氯霉素(CAP)屬廣譜抗生素，因其高效價廉而廣泛應用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中，但CAP可導致再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥，對人類健康構成嚴重威脅。中國、歐盟、美國以及一些其他的國家已禁止在動物源性食物中使用CAP[1]。歐盟規(guī)定，肉、牛奶、蛋類、水產(chǎn)品等食物中的CAP最大殘留量限值(Maximum residue limits)為0.3 μg/kg[2]。因此，建立痕量CAP的高靈敏度檢測方法十分必要。目前，檢測CAP的方法有高效液相色譜法(HPLC)[3]、液相色譜-質譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)[4]、表面增強拉曼散射法(SERS)[5]等。

分子印跡技術是近年迅速發(fā)展起來的一種制備具有特異性識別位點聚合物的新興技術。首先，模板分子與功能單體在溶劑中形成穩(wěn)定的模板-功能單體復合物，然后加入交聯(lián)劑，形成具有一定強度的網(wǎng)狀聚合物，最后采用適當?shù)姆椒ǔゾ酆衔镏械哪０宸肿?，在聚合物中留下了與模板分子大小、形狀及作用位點相匹配的空穴，可對模板分子產(chǎn)生選擇性識別作用[6-9]。分子印跡聚合物(Molecular imprinting polymer，MIP)具有高度交聯(lián)的結構以及良好的穩(wěn)定性，以MIP膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的生物分子用作識別元件，可制得選擇性和靈敏度高、穩(wěn)定性好、價格低廉的傳感器[10]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

2-丙烯酰胺-2-甲基丙基磺酸(AMPs)、對氨基苯硫酚(4-ATP)、氯霉素(CAP)、三丙胺(TPrA)、Ru(bpy)3Cl2·6H2O、二甲基丙烯酸乙二酯(EGDMA)、過硫酸銨(APS)、氯金酸(HAuCl4)、四乙氧基硅烷(TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)購于北京百靈威科技有限公司；檸檬酸鈉、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、異丙醇、甲苯、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購于北京化學試劑有限公司；氫氧化鈉、乙醇、鹽酸、乙酸購于天津福晨化學試劑有限公司；甲醇購于賽默飛世爾科技有限公司;上述所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水(Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)，法國Millipore公司)。

電化學發(fā)光實驗在MPI-A型電化學發(fā)光分析儀(西安瑞邁電子有限公司)上進行，磁性玻碳電極(MGCE)直徑3 mm，購自天津英科聯(lián)合科技有限公司。以修飾的磁性玻碳電極(MGCE)作工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl溶液)和Pt絲電極分別作參比電極和對電極。KQ218型超聲波清洗儀、KQ-400KDE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；JEM2011透射電子顯微鏡(JEOL公司)；UV-2450紫外可見吸收光譜儀、IR Prestige-21型紅外吸收光譜分析儀(島津公司)。

1.2 Fe3O4-Au磁性納米粒子的制備

根據(jù)文獻[11]制備金納米粒子(AuNPs)，并略做修改：用移液槍將1.25 mL 20 g/L的氯金酸溶液移入100 mL水中，混勻，轉移至清潔的三頸圓底燒瓶中，在水浴中將溶液加熱至沸騰(整個過程持續(xù)攪拌)，逐滴加入12 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)攪拌20 min，即得紫紅色的AuNPs溶液。

根據(jù)文獻[12-13]合成氨基功能化的Fe3O4磁性納米粒子，并略做修改：取25 mL水至燒杯中通氮除氧，將5.2 g FeCl3·6H2O和2.0 g FeCl2·4H2O溶解于除氧后的水中，加入0.85 mL 濃鹽酸，不斷攪拌下升溫至80 ℃，加入1.5 mol/L NaOH溶液，保持溫度80 ℃，繼續(xù)攪拌1 h，依次用乙醇、水清洗2次，用磁鐵分離，干燥后即得到Fe3O4粉末。取0.2 g Fe3O4分散于150 mL乙醇中，在冰浴中連續(xù)超聲15 min后，加入12 mL 28%的氨水和400 μL四乙氧基硅烷(TEOS)，繼續(xù)在冰水浴中超聲2 h，進行TEOS的水解反應。依次用乙醇、水清洗2次，用磁鐵分離，干燥后即得到核殼型的Fe3O4@SiO2納米粒子。取0.13 g Fe3O4@SiO2納米粒子均勻分散于50 mL異丙醇中，加入1 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷后，將該懸濁液加熱至40 ℃,溫和機械攪拌3 h。最后，將所得的黑色磁性納米粒子用乙醇、水清洗，重復清洗3次，用磁鐵分離，干燥后即得氨基功能化的納米粒子Fe3O4@SiO2-NH2。

將0.10 g Fe3O4@SiO2-NH2納米粒子均勻分散于13 mL 水中，加入8.0 mL AuNPs 懸濁液，在快速超聲條件下混合機械攪拌8 h，用水洗滌4次，基于Fe3O4@SiO2-NH2帶正電荷的質子化氨基與AuNPs表面帶負電荷的檸檬酸根之間的靜電吸引力作用,制得四氧化三鐵-金納米復合物，記作Fe3O4-Au。

1.3 Fe3O4-Au磁性納米復合物表面制備CAP分子印跡膜(MIPs)

圖1為CAP分子印跡傳感器的構建過程示意圖。參照文獻[14-15]制備CAP分子印跡膜：首先，將上述制備的適量Fe3O4-Au納米粒子加至含有20 mmol/L 4-ATP的甲苯溶液中，室溫下自組裝16 h后，用磁鐵分離該懸濁液，將分離的納米粒子加至含有10 mmol/L CAP的乙醇溶液中自組裝4 h。隨后將該懸濁液倒入三頸燒瓶中，依次加入0.083 g的AMPs、3 mL EGDMA、0.05 g APS，在35 ℃水浴中溫和攪拌10 h。反應完成后將上述懸濁液用磁鐵分離，用甲醇-乙酸(9∶1)混合溶液洗脫去除其中的CAP模板分子，最終得到覆蓋于Fe3O4-Au磁性納米粒子表面且對CAP具有專一識別性能的磁性分子印跡聚合物(MIPs)膜。用同樣的方法制備磁性非印跡聚合物(NIPs)膜,制備過程中不加入CAP模板分子。

圖1 CAP分子印跡電化學發(fā)光傳感器的制備過程

1.4 電致化學發(fā)光檢測方法

用0.05 μm的Al2O3粉末研磨拋光電極表面后，依次用無水乙醇、水、無水乙醇超聲清洗，晾干備用。移取8.0 μL修飾了CAP分子印跡膜的Fe3O4-Au磁性納米復合物，滴涂至磁性玻碳電極(MGCE)表面，以此為工作電極,將該電極置于不同濃度的CAP溶液中吸附CAP后，浸入含有8.0 μmol/L聯(lián)吡啶釕和100 mmol/L三丙胺的Tris-HCl緩沖溶液(pH 7.4)中，直接測定發(fā)光強度，以空白溶液中的ECL強度I0與CAP溶液的ECL強度Ip的差值ΔI(=I0-Ip)作為ECL信號。電致化學發(fā)光實驗參數(shù)設定為：掃描電位范圍：0～1.6 V,掃描速率：100 mV/s,光電倍增管電壓倍數(shù)：600 V,放大倍數(shù)：3級。

2 結果與討論

2.1 Fe3O4-Au磁性納米復合物的表征

圖2為Fe3O4(A)、AuNPs(B)及Fe3O4-Au(C)的透射電鏡(TEM)表征圖。由圖2A可知Fe3O4的粒徑約為15 nm，從圖2B可看出AuNPs的平均粒徑約為10 nm,從圖2C可清晰看到黑色球狀的AuNPs粒子與形狀不規(guī)則的Fe3O4粒子所構成的復合物Fe3O4-Au。

圖3 Fe3O4-Au的能譜分析圖

圖3為Fe3O4-Au磁性納米粒子的能譜分析圖，由圖可知主要物質成分為Fe、Au、O和Si元素，其均為Fe3O4-Au的主要元素，可以確證為Fe3O4-Au納米復合物。其中高含量Cu元素的存在，主要是因為在能譜分析中采用銅網(wǎng)所致。

2.2 CAP分子印跡膜(MIPs)的表征

圖4A、B分別為CAP的磁性分子印跡聚合物MIPs和磁性非印跡聚合物NIPs的掃描電鏡(SEM)表征圖，從圖4可以看出MIPs表面褶皺且空隙多，這為CAP分子在磁性MIPs中的傳輸和再吸附提供了良好的通道，而NIPs表面較平滑且空隙較少。

圖5 氯霉素磁性分子印跡聚合物的紅外吸收譜圖

圖6 不同的電極在含有0.10mol/L TPrA和1.0×10-5mol/L三聯(lián)吡啶釕的Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液中的電化學發(fā)光圖

2.3 傳感器的電化學發(fā)光響應

2.4 實驗條件的優(yōu)化

表1 不同方法對CAP的檢出限比較Table 1 Comparison of detection limits of different methods for determination of CAP

2.5 工作曲線

在上述優(yōu)化條件下，考察了傳感器在不同濃度CAP下的電化學發(fā)光響應，結果顯示當修飾電極在CAP中吸附富集后，會產(chǎn)生猝滅效應，且隨著CAP濃度的增高，猝滅效應增強。在0.010～100 ng/L濃度范圍內，電化學發(fā)光的猝滅強度(ΔI)與CAP濃度的對數(shù)呈良好的線性關系，其線性方程為：ΔI=4 105.9+1 580.9×logc(r=0.998 0)，檢出限(S/N=3)約為0.010 ng/L。將本方法的靈敏度與近年文獻報道的CAP檢測方法進行比較，由表1可見，本文提出的分子印跡傳感器對CAP的檢出限很低，完全可以滿足水體中痕量CAP的檢測需求。

2.6 傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性與干擾實驗

2.7 實際樣品的檢測

采用本文制備的CAP分子印跡傳感器用于實際水樣中CAP的檢測。水樣取自北京市豐臺區(qū)涼水河，測定前用0.45 μm的濾膜過濾水樣，將修飾了CAP分子印跡膜的磁性玻碳電極分別浸入原水樣和加標水樣中進行固相萃取吸附富集1.5 h，測定電化學發(fā)光信號，分別計算回收率和RSD。由表2可見，水樣加標后所得結果與標準曲線所得結果基本一致，回收率為95.2%～105%，RSD為1.4%～3.2%。

表2 水樣中CAP的檢測Table 2 Determination of CAP in water ρ/(ng·L-1)

*：no detected

3 結 論