陳碧瑩，廖世莉，吳 霞，馮毅凡

(廣東藥科大學 中心實驗室，廣東 廣州 510006)

紅木作為珍貴的家具用材，制作而成的家具和工藝品等備受青睞，價值極高[1]。根據(jù)國家紅木標準(GB/T 18107-2000)[2]，可將紅木分為5屬8類，共29種。不同種類、不同產(chǎn)地的紅木之間價格差異較大。目前紅木鑒別仍以人工鑒別為主，而人工鑒別能力參差不齊，加之市場上真假紅木魚目混珠，使得消費者不能有效地識別真?zhèn)危自斐蓳p失。國標紅木中俗稱為小葉紫檀的檀香紫檀，在市場上價格較高，而染料紫檀因價格低廉、形似檀香紫檀的特點，常被混作檀香紫檀。膠漆樹也因外觀類似紫檀，常被冒充作為紅木使用。

目前常用的傳統(tǒng)鑒別紅木的方法為觀測紅木木材的材色、紋理、氣味及其顯微結(jié)構(gòu)等[3-5]。近年來，化學檢測手法也被逐步應用于紅木鑒別。紅外光譜法[6-9]和氣相色譜法[10-12]是目前較為常用的鑒別紅木的化學方法，但兩者均易受儀器和環(huán)境影響，且氣相色譜法的樣品前處理較繁瑣。

核磁共振技術(shù)具有檢測快速、樣品處理簡單、靈敏度高、無偏向性等優(yōu)點，其中，核磁共振氫譜被越來越多地應用于植物指紋圖譜的構(gòu)建[13]。而僅靠人工鑒別對核磁共振儀這種高通量儀器所產(chǎn)生的龐大數(shù)據(jù)進行分類不僅不現(xiàn)實，還會丟失大部分有用的信息[14]。模式識別方法結(jié)合了計算機、統(tǒng)計學、數(shù)學等知識，從化學測量數(shù)據(jù)出發(fā)，進一步揭示物質(zhì)的隱含性質(zhì)，可有效地解決數(shù)據(jù)處理的難題[15]，為分析化學研究提供十分有用的決策性信息。偏最小二乘判別分析(PLS-DA)法是模式識別中常用的方法之一。

本研究將1H NMR與PLS-DA結(jié)合，對奧氏黃檀、巴里黃檀、交趾黃檀、刺猬紫檀、大果紫檀和檀香紫檀6類國標紅木，及膠漆樹、染料紫檀2類混淆品進行快速鑒別，嘗試建立有效區(qū)分上述6類國標紅木及其2類混淆品的有效方法。

1 實驗部分

1.1 實驗樣本

實驗樣本名稱及其來源如表1所示。建模所需的8類共75批次的樣本和從市場上購得的未知樣本X-1和X-2均取自木材心材部分，研磨，過40目篩，置于干燥器中常溫保存。

表1 樣本名稱及其來源Table 1 Name and resource of samples

1.2 儀器與試劑

AVANCE Ⅲ500MHz 超導NMR波譜儀(瑞士Bruker公司)，正相檢測探頭(BBO多核寬帶探頭，瑞士Bruker公司)，MestReNova軟件，5 mm直徑核磁管(美國Norell公司)，氘代甲醇MeOD(美國Sigma公司)。AUWD220D型分析天平(日本島津公司)，1 000 μL移液槍、高速離心機(美國Thermo公司)，KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品溶液的制備稱取0.1 g樣品，加入1 mL氘代甲醇，超聲30 min，13 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管，加封，即得核磁測試供試品。

1.3.21HNMR光譜分析儀器工作條件：溫度：295 K；頻率：500.13 MHz；序列：zgpr(預飽和單脈沖)；90°脈沖寬度：14 μs；掃描次數(shù)：24；掃描譜寬：16 ppm(1H NMR)；弛豫延遲：1.0 s；時域數(shù)據(jù)點數(shù)：64 k。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.11HNMR數(shù)據(jù)處理使用MestReNova軟件，將1H NMR圖譜分別進行相位矯正、基線矯正、扣除溶劑峰和水峰、歸一化和分段積分(0.04 ppm)等處理，導出數(shù)據(jù)。

1.4.2模式識別分析使用RStudio 3.3.2軟件和mixOmics 6.3.0包，對導出的核磁數(shù)據(jù)進行聚類分析、PCA和PLS-DA處理(參數(shù)設(shè)置：center=FALSE，scale=FALSE，其余參數(shù)選取默認值)。

2 結(jié)果與討論

2.1 6類國標紅木及2類混淆品的1H NMR圖

經(jīng)過相位矯正、基線矯正、扣除溶劑峰和水峰等處理的6類國標紅木及2類混淆品的1H NMR圖譜如圖1所示，圖中隨機選取8類樣本的1H NMR圖譜構(gòu)建疊加圖。由圖可知，不同種類間紅木甲醇提取液的1H NMR圖有較大差異，因此，利用化學檢測手段將其分類具有可行性。

圖1 6類國標紅木及2類混淆品的1H NMR圖

2.2 紅木分類模型的建立

2.2.16類國標紅木及2類混淆品紅木的聚類分析結(jié)果聚類分析根據(jù)相類似的樣本在多維空間中彼此的距離小，不相似的樣本在多維空間中彼此的距離大而達到分類的目的。6類國標紅木及2類混淆品紅木的聚類分析結(jié)果如圖2所示，圖中顯示了8組共75個樣本。由圖可知，刺猬紫檀(P.eri.)組、染料紫檀(P.tin.)組、大果紫檀(P.mac.)組和膠漆樹(G.sp.)組能較好地分組，其余各組間或有交集，并不能很好地進行區(qū)分。聚類分析能有效地將混淆品組與國標紅木組進行有效區(qū)分，但不同類別間的國標紅木組并不能得到有效地分類。

圖2 6類國標紅木及2類混淆品的聚類分析結(jié)果

圖3 6類國標紅木及2類混淆品的PCA結(jié)果

2.2.26類國標紅木及2類混淆品紅木的PCA結(jié)果6類國標紅木及2類混淆品紅木的PCA結(jié)果如圖3所示。由圖可知，PCA轉(zhuǎn)換后PC1和PC2的貢獻率分別為56%和15%，累積貢獻率達71%。貢獻率越大，表明其所含的信息越多，越能代表原始的數(shù)據(jù)。在PCA模型中，除大果紫檀組能較好地分組外，其余各組間或有交集，國標紅木組與混淆品組、不同類別的國標紅木組間均不能達到較好地區(qū)分。因此，PCA不適用于紅木的快速鑒別分析。

2.2.36類國標紅木及2類混淆品紅木的PLS-DA結(jié)果PLS-DA是一種有監(jiān)督的模式識別方法,能減少變量間多共線性所產(chǎn)生的影響，即自變量間的共線性越低，使用PLS-DA的效果越好。本文中1H NMR譜圖所產(chǎn)生的信號為提取物信號，提取物間的共線性較低，且PLS-DA易于識別系統(tǒng)信息和噪音，可得到更好的分類效果。6類國標紅木及2類混淆品紅木的PLS-DA結(jié)果如圖4所示。由于樣本類別較多，使用三維圖譜能更客觀地反映分類模型的性能，因此，選擇前3個主成分建立模型。PLS-DA的PC1、PC2和PC3分別為33%、28%和18%，累積貢獻率達79%。由圖4B可知，膠漆樹組和染料紫檀組2類混淆品能與國標紅木組進行良好地區(qū)分，除交趾黃檀組分別與奧氏黃檀組和檀香紫檀組間存在少量交集外，其余國標紅木間都能得到很好地區(qū)分。因此，PLS-DA適用于紅木的快速鑒別分析。

為探究紅木PLS-DA模型的實用性，本研究從市場上搜集2個未知樣本，信息如表1所示。將未知樣本分別經(jīng)“1.3”和“1.4”步驟處理后，所得結(jié)果如圖5所示。未知樣本X-1和X-2分別為從市場購得的未經(jīng)鑒別的絨毛黃檀和交趾黃檀。由圖5可知，樣本X-1游離于識別模型的8個類別之外，證明其不屬于本研究中的6類國標紅木或2類混淆品類別；樣本X-2在模型中被歸入交趾黃檀組別中，與市場購入的標識組別相一致。因此，本研究基于PLS-DA構(gòu)建的紅木快速識別模型對未知樣本也有較好的分類效果。

進一步分析PLS-DA模型所使用的PC1、PC2和PC3的組成，其前15個權(quán)重大的變量如圖6所示。在δH1.18～1.26、δH3.70～3.90，δH6.66～6.70，δH6.74～6.82和δH6.86～6.90處各類樣品間有較大的差異。根據(jù)文獻可知[10,17]，紅木的甲醇提取物中富含黃酮類成分，本實驗中1H NMR譜圖的特征峰與黃酮類化合物相符。因此，可初步判斷δH1.18～1.26處為取代烷基上的H原子信號，δH3.70～3.90處為與苯基相連的取代氧甲基上的H原子信號，δH6.66～6.70、δH6.74～6.82和δH6.86～6.90處為與苯基直接相連的H原子信號。

在8類樣本中，不同變量的最大表達和最小表達如圖6所示。大果紫檀在δH1.18～1.26中具有最大的表達，即可認為在δH1.18～1.26處具有特征信號的化合物在大果紫檀組別中的含量應為最大。與此相反，巴里黃檀和奧氏黃檀分別在δH1.18～1.22、δH1.22～1.26中有最小的表達。由此可初步推斷，δH1.18～1.26是區(qū)分大果紫檀和巴里黃檀、奧氏黃檀的主要特征區(qū)間。

交趾黃檀在δH3.70～3.74和δH3.86 ～3.90處具有最大的表達，刺猬紫檀在δH3.74～3.78處具有最大的表達，染料紫檀在δH3.78～3.86中具有最大的表達。與此相反，刺猬紫檀在δH3.70～3.74中具有最小的表達，膠漆樹在δH3.74～3.90中具有最小的表達。由此可初步推斷，δH3.74～3.90是區(qū)分混淆品膠漆樹與其余組別的主要特征區(qū)間，而δH3.70～3.74是區(qū)分交趾黃檀與刺猬紫檀的主要特征區(qū)間。

染料紫檀在δH6.66～6.70中具有最大的表達，膠漆樹在δH6.74～6.82中具有最大的表達，刺猬紫檀在δH6.86～6.90中具有最大的表達。與此相反，刺猬紫檀在δH6.66～6.70和δH6.74～6.82中有最小的表達，大果紫檀在δH6.86～6.90中具有最小的表達。由此可初步推斷，δH6.66～6.70和δH6.74～6.82是區(qū)分混淆品染料紫檀、膠漆樹與刺猬紫檀的主要特征區(qū)間，δH6.86～6.90是區(qū)分刺猬紫檀和大果紫檀的主要特征區(qū)間。

圖4 6類國標紅木及 2類混淆品PLS-DA分類結(jié)果的2D(A)和3D(B)圖

3 結(jié) 論

本研究采用核磁共振技術(shù)和PLS-DA模式識別方法對8類共75批次的紅木核磁共振氫譜數(shù)據(jù)進行處理，建立了核磁共振技術(shù)與模式識別方法相結(jié)合的紅木快速鑒別新方法。結(jié)果表明，PLS-DA適用于紅木的快速鑒別分析，能有效地區(qū)分國標紅木及其混淆品，除交趾黃檀組分別與奧氏黃檀組和檀香紫檀組間存在少量交集外，其余國標紅木均能得到很好地區(qū)分。該方法具有快速、靈敏度高、準確等優(yōu)點，不受主觀因素、環(huán)境和儀器的影響，是一種快速鑒別紅木種類的可行之法。