張慧蕓，何 鵬，李鑫玲，康懷彬*

（河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023）

近年來，隨著人們生活節(jié)奏的加快和生活水平的提高，消費(fèi)者對調(diào)理肉制品和即食肉制品的需求迅速增長；同時化學(xué)合成防腐劑和抗氧化劑的安全性問題也越來越引起人們的廣泛關(guān)注。采用對產(chǎn)品或環(huán)境無任何不良影響的天然抗氧化劑和抗菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學(xué)添加劑改善肉及肉制品品質(zhì)已成為目前研究熱點(diǎn)[1]。在食品工業(yè)中，香辛料和草藥不但可被用作風(fēng)味劑賦予食品一定的風(fēng)味、香氣和辛辣感，也可以作為天然保鮮劑用于食品保藏[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)精油作為天然抗氧化劑或抗菌劑使用可保持和改善肉和肉制品的整體品質(zhì)[3-5]。丁香精油是從丁香樹的花蕾、葉子等提取的芳香精油，具有良好的抑菌和抗氧化效果[6-8]，為我國GB 2760ü2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[9]規(guī)定允許使用的食用香料。然而精油與食物組分之間的相互作用及精油的高揮發(fā)性、低水溶性，特別是較高濃度的精油會給食品的感官品質(zhì)帶來負(fù)面影響以及精油在加工、使用和儲存過程中對氧、光和熱較為敏感等原因[2]，限制了精油作為食品防腐劑的應(yīng)用。微膠囊化精油是提高精油溶解度和穩(wěn)定性的最有效技術(shù)之一，微膠囊化可以掩蓋精油的不良味道和氣味，控制活性物質(zhì)的釋放[10]。近年來，納米級生物活性物質(zhì)的開發(fā)成為研究熱點(diǎn)，與傳統(tǒng)微膠囊相比，亞細(xì)胞尺寸的納米膠囊具有相對較高的細(xì)胞吸收和特異性，同時具有較高的載藥能力和生物活性物質(zhì)釋放面積，生物活性高[11]。

由于殼聚糖具有生物相容性、低毒性和生物可降解性，殼聚糖納米微粒非常適合作為壁材包埋精油[12]。此外，殼聚糖具有廣泛的生物活性，包括抗菌、抗氧化、殺蟲和黏結(jié)性。殼聚糖具有包埋疏水性和親水性生物活性物質(zhì)的潛力，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景[10,12-13]。已有文獻(xiàn)報道添加精油的可食用膜在肉制品中的應(yīng)用[14-16]，但關(guān)于膠囊化精油對肉制品的保鮮效果研究甚少。本實驗采用離子凝膠法，以殼聚糖為壁材制備丁香精油納米膠囊，研究丁香精油納米膠囊的物理性能及其對調(diào)理豬肉餅4 ℃冷藏期間菌落總數(shù)、脂肪氧化、色差、pH值、高鐵肌紅蛋白含量以及感官品質(zhì)的影響，為開發(fā)應(yīng)用新型肉及肉制品保鮮劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度95%） 南通興成生物制品廠；丁香精油（丁香酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞90%） 上海銘睿生物科技有限公司；三聚磷酸鹽、冰醋酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫-80、甘油 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9003型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；UV-2450PC紫外-可見分光光度計 日本島津公司；PHS-3C pH計 上海精科有限公司；CR-400便攜式色差儀 日本Konica Minolta公司；ZFS高速攪拌機(jī) 上海臻煊機(jī)電科技有限公司；DV-1數(shù)字式黏度計上海倫捷機(jī)電儀表有限公司；Zeta Sizer-3000HSA型動態(tài)光散射激光粒度儀、Sizer-2000型Zeta電位測定儀 英國Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香精油納米膠囊的制備

參考Ghaderi-Ghahfarokhi等[10]的方法，采用離子凝膠法制備丁香精油納米膠囊。將殼聚糖溶于體積分?jǐn)?shù)1%冰醋酸中，制成3.2 mg/mL的殼聚糖溶液，超聲水浴1 h，采用微孔濾紙過濾，調(diào)節(jié)濾液pH值至4.0。取50 mL上述殼聚糖溶液加入80 mg吐溫-80，60 ℃ 攪拌 30 min得到均勻混合物。取128 mg精油溶于4 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中，將精油逐滴加入冷卻的殼聚糖溶液中，殼聚糖與精油的質(zhì)量比為1∶0.8，1 200 r/min攪拌20 min。取30 mL 1.87 mg/mL三聚磷酸鹽（pH 4.0）逐滴加入殼聚糖-精油乳化液中，900 r/min持續(xù)攪拌60 min，形成丁香精油納米膠囊懸浮液。

1.3.2 丁香精油納米膠囊物理特性的研究

1.3.2.1 粒徑、ζ-電勢和多分散指數(shù)的測定

采用動態(tài)光散射激光粒度儀測定納米膠囊粒徑和多分散指數(shù)。多分散指數(shù)值表示粒徑分布的不均勻性，多分散指數(shù)值接近0表示粒徑均勻分布，接近1表示粒徑分布不均勻。采用Zeta電位測定儀測定納米膠囊ζ-電勢。

1.3.2.2 包埋率和累積釋放率

參考Keawchaoon等[17]的方法測定丁香精油納米膠囊的包埋率和累積釋放率。

包埋率的計算見式（1）。

采用24 000 r/min低溫（4 ℃）離心45 min，從1.3.1節(jié)制得的懸浮液中分離出殼聚糖-精油納米膠囊，將其懸浮在5 mL醋酸鹽緩沖溶液（pH 5）中200 r/min振搖。不同時間取樣，9 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液加入等體積的新配制醋酸鹽緩沖溶液中。采用紫外-可見分光光度計測定285 nm波長處吸光度，并計算精油釋放量。精油累積釋放率計算見式（2）。

式中：mt為各采樣時間的精油釋放量/mg；m0為初始負(fù)載精油質(zhì)量/mg。

1.3.3 豬肉餅的制備方法

超市購新鮮豬肉，去除筋膜及多余的脂肪，瘦肉與肥肉的質(zhì)量比為4∶1，然后用絞肉機(jī)絞碎，按碎肉質(zhì)量加入2%食鹽、0.2%復(fù)合磷酸鹽、3%淀粉、0.6%卡拉膠、15%冰水混勻后，隨機(jī)分成5 組，第1組為對照組（control），第2、3組按質(zhì)量分別添加0.05%、0.10%丁香精油（分別記作0.05% CLEO、0.10% CLEO），第4、5組按質(zhì)量分別添加0.05%丁香精油納米膠囊、0.10%丁香精油納米膠囊（分別記作0.05% CLEO-CNS、0.10% CLEO-CNS），手動攪拌均勻后，放入斬拌機(jī)中，用最低斬拌速率（刀速1 400 r/min、鍋速10 r/min）充分?jǐn)匕?，制成大約7.5 cm（直徑）×1.5 cm（厚度）的肉餅。每兩個肉餅放入聚丙烯托盤中，用聚乙烯保鮮膜封好，（4f1）℃下保存，分別在第0、2、4、6、8天測定各項指標(biāo)。

1.3.4 丁香精油納米膠囊對冷藏調(diào)理豬肉餅品質(zhì)的影響

1.3.4.1 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)的測定參考GB 4789.2ü2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[18]。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定新鮮肉菌落總數(shù)為1～104CFU/g，次鮮肉為104～106CFU/g，變質(zhì)肉超過106CFU/g。稱取被檢樣品10 g，放入90 mL無菌生理鹽水中，在搖床中振搖30 min，然后取1 mL上清液進(jìn)行加倍遞增稀釋，采用普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板傾注法，在37 ℃下有氧培養(yǎng)48 h后計數(shù)，結(jié)果以菌落總數(shù)的對數(shù)值表示。

1.3.4.2 TBARS值的測定

硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）值的測定參考Zhang Lin等[19]的方法，略加改進(jìn)。取1 g肉樣加入10 mL蒸餾水，12 000 r/min勻漿3 次，每次30 s。取0.2 mL勻漿液，依次加入0.2 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)8.1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、1.5 mL體積分?jǐn)?shù)20%醋酸緩沖液、1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8% TBA溶液和0.6 mL蒸餾水，混勻后沸水浴中保持30 min，用流動的自來水冷卻至室溫，加入4 mL氯仿混勻，3 000 r/min離心10 min，532 nm波長處測吸光度。用1,1,3,3-四乙氧基丙烷做標(biāo)準(zhǔn)曲線，TBARS值以每千克肉樣所含丙二醛的質(zhì)量表示，單位為mg/kg。

1.3.4.3 pH值和色澤的測定

pH值的測定按照GB 5009.237ü2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》[20]。色差測定參照Rubio等[21]的方法，并略作修改。色差儀使用前先用標(biāo)準(zhǔn)板進(jìn)行校正，采用D65光源、8 mm直徑測量范圍及10°標(biāo)準(zhǔn)觀察角對肉餅表面的色澤（亮度L*、紅度a*、黃度b*）進(jìn)行測定。每個樣品取上表面均勻分布的6 處不同位置進(jìn)行測量并求其平均值。

1.3.4.4 高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)參照Krzywicki[22]的方法，并加以改進(jìn)。取5 g肉樣置于已加有5 mL冰冷磷酸緩沖液（pH 6.8，40 mmol/L）的50 mL聚乙烯離心管中，4 000 r/min均質(zhì)20 s，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心15 min，過濾取上清液，分別測量525、545、565、572 nm波長處的吸光度（A），以磷酸緩沖液為對照。

式中：R1、R2、R3分別是吸光度比值A(chǔ)572nm/A525nm、A565 nm/A525 nm、A545 nm/A525 nm。

1.3.4.5 感官分析

參照Pohlman等[23]的方法進(jìn)行感官分析。采用5 分制評定肉樣的顏色、氣味、精油氣味和總體可接受性。其中5 分為非常喜歡，1 分為非常厭惡，3 分以下為不可接受。感官評定小組由10 名經(jīng)過培訓(xùn)的成員組成，均來自河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院。感官評定在控制溫度、濕度及燈光的單獨(dú)感官評定小室中進(jìn)行。分別在冷藏0、4、8 d取樣進(jìn)行感官評定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)的平均值，用Statistix 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，通過最小顯著差值（least significant difference，LSD）進(jìn)行差異顯著性分析，用SigmaPlot 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁香精油納米膠囊的物理性能

丁香精油納米膠囊的平均粒徑為254.7 nm，ζ-電勢為35.4 mV，多分散指數(shù)為0.33。精油包埋率為39.65%，此結(jié)果高于Woranuch等[13]報道的殼聚糖-丁香酚納米膠囊的包埋率。

圖1 丁香精油納米膠囊的釋放曲線（pH 5.0）Fig.1 Release curve of clove essential oil nanocapsules at pH 5.0

為模擬丁香精油納米膠囊在食品中的釋放機(jī)制，采用醋酸鹽緩沖溶液作為釋放基質(zhì)。由圖1可以看出，精油的累積釋放率初始階段快速上升，隨后緩慢增加，最終達(dá)到平穩(wěn)期。在第一階段，在最初9 h內(nèi)丁香精油的釋放速率最快，精油的累積釋放率為40.54%，一方面是由于納米膠囊表面的游離精油和包埋在納米膠囊表層附近的精油瞬時擴(kuò)散；另一方面是由于納米膠囊表面附近的濃度差較大和殼聚糖聚合物的溶解速率高。第二階段釋放速率逐漸降低，直到69 h后達(dá)到恒定值；精油釋放率從40.54%上升到63.59%，這主要是由精油在納米膠囊中的擴(kuò)散作用和殼聚糖聚合物的降解引起的；108 h后停止釋放。釋放曲線結(jié)果表明丁香精油納米膠囊具有在豬肉餅貯藏過程中持續(xù)釋放精油的潛力。

2.2 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間菌落總數(shù)的影響

圖2 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間菌落總數(shù)的影響Fig.2 Effect of clove essential oil nanocapsules on APC of pork patties during storage at 4 ℃

由圖2可知，冷藏結(jié)束時，與對照組相比，0.05% CLEO和0.10% CLEO處理組菌落總數(shù)分別降低了1.49、2.35（lg（CFU/g）），0.05% CLEO-CNS和0.10% CLEO-CNS處理組菌落總數(shù)分別降低了2.51（lg（CFU/g））和2.89（lg（CFU/g））。CLEO和CLEO-CNS處理組豬肉餅貨架期延長了2～4 d。精油的組成影響其抗菌性能，丁香精油主要成分為丁香酚、β-丁香烯、乙酰丁香酚以及甲基正戊基酮、水楊酸甲酯等[22]。丁香酚對酶（如細(xì)菌ATP酶或霉菌細(xì)胞壁合成酶）活性具有很好的抑制作用，并且可以干擾細(xì)菌細(xì)胞膜的合成[2,23]。丁香精油納米膠囊能夠有效控制丁香精油的釋放，而丁香精油只是短期內(nèi)能降低微生物數(shù)量。Sadgrove等[26]研究表明，將茶樹精油制成微膠囊可提高精油的抗菌活力，因此推斷將精油包埋可減少精油的揮發(fā)，有利于其向細(xì)菌細(xì)胞壁的遷移。Keawchaoon等[17]研究表明，質(zhì)量濃度低于8.23 mg/mL的殼聚糖納米粒子對微生物沒有抑制作用。

2.3 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間TBARS值的影響

圖3 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間TBARS值的影響Fig.3 Effect of clove essential oil nanocapsules on TBARS value of pork patties during storage at 4 ℃

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，對照組TBARS值顯著升高，貯藏結(jié)束時達(dá)到1.49 mg/kg。Sheard等[27]指出當(dāng)豬肉或牛肉TBARS值大于0.5 mg/kg時，可聞到肉制品的酸敗味。各處理組TBARS值隨著貯藏時間的延長逐漸升高，但除了0.05% CLEO處理組以外，其他處理組TBARS值都沒有超過感官臨界值（0.5 mg/kg）。丁香酚具有較強(qiáng)的抑制丙二醛生成的抗氧化活性，Kong Baohua等[28]報道了丁香提取物能顯著抑制豬肉餅的脂質(zhì)二級氧化，與本研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，丁香精油納米膠囊在較低含量時即可抑制脂質(zhì)氧化，可以推斷微膠囊化可防止精油在貯藏過程中的揮發(fā)和分解。此外，殼聚糖具有一定的抗氧化活性，殼聚糖可與脂肪衍生物相互作用，并具有螯合肌紅蛋白釋放的鐵離子的能力。Jung等[29]報道了采用涂布微膠囊辣根提取物的普通塑料膜包裝能顯著抑制豬肉和魚肉中丙二醛的產(chǎn)生，與本研究結(jié)果一致。

2.4 丁香精油納米膠囊對豬肉餅色澤的影響

表1 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間色澤的影響Table1 Effects of clove essential oil nanocapsules on color of pork patties during storage at 4 ℃

由表1可知，在貯藏初期，0.05% CLEO處理組和0.10% CLEO處理組L*值顯著高于其他處理組（P＜0.05）。隨著貯藏時間的延長，對照組和各處理組L*值均顯著增加（P＜0.05），但0.05% CLEO-CNS處理組和0.10% CLEO-CNS處理組L*值增加緩慢，在貯藏末期與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。

隨著貯藏時間的延長，對照組和各處理組a*值呈逐漸降低趨勢，在貯藏初期各組之間差異不顯著（P＞0.05）。在貯藏結(jié)束時，對照組、0.05% CLEO、0.10% CLEO、0.05% CLEO-CNS、0.10% CLEO-CNS處理組a*值與初始相比分別降低了34.9%、34.4%、32.1%、25.8%、13.2%。雖然0.10% CLEO-CNS處理組在貯藏前2 d的a*值有所降低，但在以后的貯藏過程中a*值趨于穩(wěn)定，這與丁香精油納米膠囊的緩釋作用有關(guān)[30]。

隨著貯藏時間的延長，對照組和處理組b*值逐漸增加。貯藏結(jié)束時，CLEO處理組b*值與對照組接近。添加丁香精油納米膠囊抑制了肉樣b*值的增加，貯藏結(jié)束時，0.10% CLEO-CNS處理組b*值最低，與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。這可能是由于丁香精油納米膠囊抑制了高鐵肌紅蛋白的形成。Hu Jing等[31]研究表明，添加肉桂精油微膠囊顯著抑制了冷卻豬肉貯藏過程中b*值的增加。

2.5 丁香精油納米膠囊對豬肉餅pH值的影響

肉樣最初pH值為5.84～5.86。由圖4可以看出，隨著貯藏時間的延長，對照組與處理組肉餅pH值均稍有升高，其中對照組pH值升高明顯，在貯藏結(jié)束時達(dá)到6.01，這可能是微生物降解氨基酸產(chǎn)生的揮發(fā)性堿（如氨和三甲胺）積累引起的[32]。在貯藏6 d后，CLEO-CNS處理組pH值顯著低于對照組（P＜0.05），說明丁香精油納米膠囊在豬肉餅冷藏期間更好地發(fā)揮了抑菌作用，降低了豬肉餅的腐敗變質(zhì)程度。

2.6 丁香精油納米膠囊對豬肉餅高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖5 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.5 Effect of clove essential oil nanocapsules on MMb content of pork patties during storage at 4 ℃

高鐵肌紅蛋白的積累是導(dǎo)致生肉糜逐漸由紅色變?yōu)楹稚闹饕騕33]，可通過降低高鐵肌紅蛋白濃度提高氧合肌紅蛋白濃度，從而保留肉的鮮紅色。如圖5所示，隨著貯藏時間的延長，對照組和處理組高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高，這也證實了樣品紅度a*值的降低。豬肉餅冷藏4 d后，CLEO處理組和CLEO-CNS處理組高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于對照組（P＜0.05），這可能由于丁香精油具有清除肉中產(chǎn)生的自由基的能力；CLEO-CNS處理組高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于CLEO處理組（P＜0.05），這與丁香精油納米膠囊的緩釋作用有關(guān)。貯藏結(jié)束時，對照組、0.05% CLEO、0.10% CLEO、0.05% CLEO-CNS、0.10% CLEO-CNS處理組高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為70.58%、62.15%、59.00%、48.23%、42.19%，相互之間差異顯著（P＜0.05）。因此，添加膠囊化精油顯著提高了肉樣的紅色穩(wěn)定性。

2.7 丁香精油納米膠囊對豬肉餅感官指標(biāo)的影響

表2 丁香精油納米膠囊對豬肉餅冷藏期間感官指標(biāo)的影響Table2 Effect of clove essential oil nanocapsules on sensory attributes of pork patties during storage at 4 ℃

由表2可知，貯藏結(jié)束時，對照組、0.05% CLEO和0.10% CLEO處理組的顏色分值降低到感官不可接受分值（3 分）以下，而0.05% CLEO-CNS和0.10% CLEO-CNS處理組仍呈現(xiàn)可接受的紅色，這與色澤和高鐵肌紅蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果一致。對于氣味分值，對照組第4天降到2.7 分，而CLEO和CLEO-CNS處理組在第8天仍均高于3 分。肉品中不良?xì)馕兜漠a(chǎn)生主要與脂質(zhì)氧化產(chǎn)物如丙二醛和微生物腐敗有關(guān)；對于丁香精油氣味，0.10% CLEO處理組分值在貯藏過程中始終低于3 分，感官上不可接受；CLEO-CNS處理組的精油氣味分值隨貯藏時間的延長而降低，但在第8天并沒有達(dá)到不可接受分值，這是由于精油的緩慢釋放作用。因此，將精油膠囊化不但保留了精油的抗氧化和抗菌活性，同時可得到令人滿意的感官品質(zhì)。

與初始相比，第4天時，對照組、0.05% CLEO、0.10% CLEO處理組的總體可接受性下降，低于最低總體可接受分值。0.05% CLEO-CNS和0.10% CLEO-CNS處理組在第8天時仍具有較高的總體可接受分值，分別為3.80 分和4.07 分，這是由于添加的膠囊化精油顯著抑制了豬肉餅在冷藏過程中的變色、脂質(zhì)氧化和微生物生長。感官評分結(jié)果表明，將精油膠囊化可避免較高濃度精油的強(qiáng)烈氣味對產(chǎn)品造成的不良影響。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用丁香精油雖然可以抑制豬肉餅微生物腐敗和脂質(zhì)氧化，但其對豬肉餅感官品質(zhì)負(fù)面影響較大；且隨著冷藏時間的延長，丁香精油逐漸揮發(fā)，導(dǎo)致其抗氧化和抗菌活性下降。由于丁香精油納米膠囊具有緩釋作用，將其添加到豬肉餅中不僅延長了其抗菌抗氧化作用時間，顯著抑制了豬肉餅脂質(zhì)氧化和微生物生長，且對豬肉餅冷藏期間的感官指標(biāo)沒有不良影響。本研究為運(yùn)用納米膠囊技術(shù)開發(fā)新型天然肉制品保鮮劑提供了理論依據(jù)。