丁夢璇，劉秀*，劉伯揚(yáng)，梁玉林，周振森，尹建軍，宋全厚

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 2(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司，質(zhì)量安全管理系統(tǒng)中心實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，011517)

志賀氏菌(Shigella)是一類具有較強(qiáng)傳染性和危害性的腸道致病菌，常引發(fā)細(xì)菌性痢疾，是嚴(yán)重威脅人類健康的因子之一[1]。有研究表明，全球每年有1.6 億人因感染志賀氏菌患病，其中99%在發(fā)展中國家[2]。發(fā)展中國家每年因志賀氏菌感染而致死的有110萬人，其中60%以上為5歲以下兒童[3]?，F(xiàn)有多種檢測志賀氏菌的方法，包括傳統(tǒng)國標(biāo)檢驗、自動化分析技術(shù)(VITEK)、分子技術(shù)(PCR)、免疫學(xué)法(ELISA、SPA)等，但這些方法都有操作繁瑣、耗時長、靈敏度低等不足,不能用于現(xiàn)場的快速檢測[4]。日本學(xué)者NOTOMI等[5]在2000年提出一種新的核酸擴(kuò)增方法—環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，在恒定溫度下，利用鏈置換循環(huán)快速擴(kuò)增靶序列，以達(dá)到檢出閾值，且反應(yīng)結(jié)果除了通過瓊脂糖凝膠電泳和濁度檢測等手段鑒定外，還能根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線來判斷。傳統(tǒng)的LAMP檢測主要以DNA為檢測模板進(jìn)行擴(kuò)增[6-7]，如果樣本中食源性致病菌已無致病活性而DNA仍殘留，仍能擴(kuò)增成功，得出假的陽性結(jié)果[8]?，F(xiàn)有的研究多采用疊氮溴乙錠(ethidium bromide monoazide,EMA)等特異的DNA結(jié)合染料，分辨死菌DNA、受損細(xì)胞DNA和游離DNA，從而剔除死菌的干擾[9]。但是EMA毒性較大，且需要光照等外界條件，操作比較繁瑣。有研究表明，在一些細(xì)胞壁較厚的病原菌檢測中，EMA不能很好地區(qū)分死菌和活菌[10]。

RNA較易降解，當(dāng)致病菌受到外界損傷而失活時，其RNA也會隨之快速降解，因此，建立以RNA為檢測模板的技術(shù)——反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(RT-LAMP)， 更符合當(dāng)前食品安全對志賀氏菌檢測的需求。鑒于乳及乳制品較易受到志賀氏菌的污染，且脫脂乳作為測試基質(zhì)，具有較穩(wěn)定的性能，不會對實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾。本次試驗選取ipaH基因作為靶基因，脫脂乳作為人工污染的樣本，建立基于RT-LAMP技術(shù)的志賀氏菌快速檢測方法，旨在為志賀氏菌的快速檢驗提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實驗共用標(biāo)準(zhǔn)菌株23株。包括4株志賀氏菌，福氏志賀(ShigellaflexneriCMCC 51572)、宋內(nèi)志賀(ShigellasonneiCMCC 51592)、鮑氏志賀(ShigellaBoydiiATCC 9207)、痢疾志賀(ShigelladysenteriaeCMCC 51105)，及19株其他腸道菌，所有菌株由本實驗室保存。

志賀氏菌檢驗培養(yǎng)基，北京路橋技術(shù)股份有限公司；脫脂乳，伊利乳業(yè)有限公司；溶菌酶Lysozyme溶液(RT401)，天根生化科技(北京)公司；焦碳酸乙二酯(DEPC)，中科瑞泰(北京)生物科技有限公司；RNesay Mini Kit(50)，德國Qiagen公司；等溫擴(kuò)增試劑Isothermal Master Mix(IMM)，英國OptiGene Limited公司；Trans2K DNA Marker，北京全世金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-700高壓滅菌鍋，日本TOMY公司；AC2-6S1生物安全柜，新加坡ESCO公司；5804R型和5424型離心機(jī)，德國Eppendorf公司；BioDrop-uLite型超微量蛋白核酸分析儀，英國Biochrom公司；GenieⅢ型快速等溫擴(kuò)增儀，英國OptiGene Limited公司；TProfessional Trio 48型三槽PCR儀，德國Biometra公司；JY-300C型電泳儀，北京君意東方儀器公司；Quantum ST5型全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，法國Vilber Lourmat公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計及篩選

根據(jù)Genebank公布的志賀氏菌屬ipaH基因序列，選取福氏志賀(Accession：M76445)、宋內(nèi)志賀(Accession： LC111511.1)、鮑氏志賀(Accession： LC111512.1)、痢疾志賀(Accession：LC111513.1)進(jìn)行多重比對，選取高度保守區(qū)，運(yùn)用LAMP Primer Explorer 4(http://primer explorer.jp/elamp4.0.0/index.htm l)在線設(shè)計4套引物，每套引物均包括：外引物F3和B3、內(nèi)引物FIP和BIP、環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopR。同時設(shè)計相應(yīng)RT-PCR的引物F和R，引物序列詳細(xì)信息見表1。

表1 志賀氏菌ipaH基因引物序列Table 1 The RT-LAMP and RT-PCR primer sequence of Shigella ipaH gene

將4套引物分別進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，根據(jù)引物擴(kuò)增的特異性和熒光閾值(Cq值)，篩選一套最優(yōu)的RT-LAMP引物。

1.3.2 志賀氏菌RNA提取

以5 mL滅菌的營養(yǎng)肉湯接種志賀氏菌，于36 ℃培養(yǎng)過夜。取1 mL培養(yǎng)后菌液5 000×g離心10 min，收集菌體沉淀。以適量質(zhì)量濃度0.85%生理鹽水重懸菌體沉淀，制備OD600為0.15的菌懸液，并對制備的菌懸液進(jìn)行平板計數(shù)。取1 mL制備的菌懸液5 000 ×g離心10 min，收集菌體沉淀。向菌體沉淀中加入10 μL 蛋白酶K和100 μL TE(溶菌酶的終濃度：15 mg/mL)，混勻，室溫下靜置反應(yīng)30 min，按照RNeasy Mini kit操作步驟提取RNA。

提取RNA的質(zhì)量檢測：取1 mL提取液，經(jīng)超微量核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度。通過OD260確定提取液的濃度，通過OD260∶OD280評估提取液的純度[11]，對符合純度要求的提取液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測其完整性。純度和完整性均符合要求的提取液置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 反應(yīng)體系及條件

制備的RT-LAMP反應(yīng)終體積為12.5 μL，包括模板1.5 μL、IMM7.5 μL、引物3.5 μL。其中外引物2.5 pmol、內(nèi)引物10 pmol、環(huán)引物5 pmol。在溫度65 ℃，反應(yīng)時間為30～60 min。

RT-PCR反應(yīng)按照PrimeScriptTM RT-PCR Kit操作說明進(jìn)行。

1.3.4 RT-LAMP反應(yīng)的準(zhǔn)確性

為了驗證RT-LAMP方法的準(zhǔn)確性，建立活菌/損傷菌檢測模型。選取105～101CFU/mL 5個菌液梯度，每個梯度2個平行樣本，一份作為活性菌樣本，另一份以121 ℃高壓滅菌30 min，靜置至室溫，模擬損傷菌樣本。分別提取2份樣本的不同梯度志賀氏菌菌液RNA，進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)。剩余菌液按照GB 4789.5—2012方法同步檢測[12]，并重復(fù)試驗3次，結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3.5 RT-LAMP反應(yīng)的特異性和靈敏度

分別對23株細(xì)菌進(jìn)行RNA提取,RT-LAMP反應(yīng)，以驗證本方法對志賀氏菌屬的檢出能力和對其他腸道菌的抗干擾能力。

其他文獻(xiàn)中方法靈敏性設(shè)計為：將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，再提取核酸，反應(yīng)后對結(jié)果進(jìn)行比較。這種設(shè)計存在一個漏洞，即每次核酸提取的效率和質(zhì)量都不同，不同反應(yīng)模板對結(jié)果的影響不能排除。本實驗為排除不同模板的影響，將1.3.2所得的RNA提取液進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取7 fg/μL、70 fg/μL、700 fg/μL、7 pg/ μL、70 pg/ μL、700 pg/ μL、7 ng/μL共計7個梯度，每梯度取1.5 μL作為反應(yīng)模板進(jìn)行RT-LAMP反應(yīng)，測定本方法對RNA模板的檢測靈敏度。

1.3.6 RT-LAMP和RT-PCR在人工污染脫脂乳中的靈敏度對比

人工脫脂乳樣本的制備：為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗所用脫脂乳經(jīng)國標(biāo)GB 4789.5—2012方法檢測不含志賀氏菌。無菌稱取25 g脫脂乳加入225 mL 生理鹽水中，混勻，制成人工脫脂乳樣品。

人工污染脫脂乳樣本的制備：取新鮮培養(yǎng)的志賀氏菌斜面，用生理鹽水洗脫，對洗脫菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，取各梯度菌液1 mL分別加入人工脫脂乳樣品中，混勻，使樣本中的菌液濃度達(dá)到10-1～105CFU/mL，作為人工污染脫脂乳樣本。

以1 mL的人工脫脂乳樣本為陰性對照，以1 mL各梯度的人工污染脫脂乳樣本為檢測樣本，分別提取RNA，進(jìn)行RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)，比較2種方法的檢測靈敏度。為方便比較，同時取1 mL各梯度菌液進(jìn)行平板菌落計數(shù)，記錄各梯度樣本中志賀氏菌的準(zhǔn)確含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選

圖1和圖2分別為4套設(shè)計引物在檢測模板是否缺失條件下的RT-LAMP擴(kuò)增結(jié)果。由圖1可知，在檢測模板缺失條件下，1號、2號、3號引物組均有擴(kuò)增檢出。在排除實驗環(huán)境等因素干擾后，分析可能為引物間堿基的互補(bǔ)配對，導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，應(yīng)舍棄。

圖1 志賀氏菌引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The result of Shigella primer amplification注：檢測模板缺失。

由圖2可知，反應(yīng)體系中含有檢測模板時，4號引物組的擴(kuò)增檢出時間(Cq值)最短，說明該引物組的擴(kuò)增效果最好。綜合圖1和圖2的結(jié)果，選擇4號引物組作為志賀氏菌RT-LAMP擴(kuò)增的最佳引物組，其序列信息見表1。

圖2 志賀氏菌引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The result of Shigella primer amplification注：檢測模板存在。

2.2 熔解曲線分析引物擴(kuò)增特異性

LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物為含有多種DNA片段的混合物，雖然片段大小不同，但其GC含量應(yīng)趨于一致。基于這一原理，可通過監(jiān)測每一次擴(kuò)增完退火溫度的熒光信號，根據(jù)熒光信號所組成的熔解曲線來評價引物的擴(kuò)增特異性。引物擴(kuò)增特異性好的熔解曲線應(yīng)為單峰，且退火溫度(Tm值)在80～90 ℃；若熔解曲線為多峰，則表明引物擴(kuò)增出其他非特異性產(chǎn)物，應(yīng)舍棄；若Tm值在90 ℃之外，則表明擴(kuò)增產(chǎn)物可能為引物二聚體，該引物也應(yīng)舍棄。由圖3可知，使用4號引物組擴(kuò)增后，熔解曲線僅有單峰，且Tm值為89 ℃，表明該引物的擴(kuò)增特異性好，可以用于后續(xù)實驗。

圖3 4號引物熔解曲線Fig.3 Dissociation curve of primer 4

2.3 RNA提取質(zhì)量評價

提取RNA的純度和完整性是進(jìn)行后續(xù)RT-LAMP和RT-PCR的關(guān)鍵因素。測得OD260∶OD280值在1.9～2.1， 表明樣本是純度高的RNA，低于1.8則表示有蛋白質(zhì)等污染，高于2.2則表示RNA可能已經(jīng)降解。本次提取RNA溶液的OD260∶OD280為2.08，濃度為76.44μg/mL，符合純度要求。由圖4可知，本次提取RNA溶液僅有16S和23S兩個清晰條帶，且無嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，說明所提取的RNA降解程度較少，完整性較高。綜上所述，提取的RNA符合純度及完整性的要求，可用于后續(xù)實驗。

M-Trans2K DNA Marker;1和2為志賀氏菌提取RNA圖4 瓊脂糖凝膠電泳檢測志賀氏菌RNAFig.4 Detection of Shigella RNA by electrophoresis

2.4 RT-LAMP擴(kuò)增的準(zhǔn)確性

食品在日常的加工、運(yùn)輸及儲存過程中，由于受到環(huán)境影響而使得其所含致病菌處于多種狀態(tài)。當(dāng)病原菌處于損傷狀態(tài)時，可能部分生理生化反應(yīng)能力減弱，但其致病性仍然存在，傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測法基于生理反應(yīng)的判定則會導(dǎo)致漏檢，而基于靶基因的分子檢測則能有效檢出。建立活菌/損傷菌模型旨在初步模擬實際樣品中致病菌不同狀態(tài)，實驗室內(nèi)的損傷模擬也僅限于高壓處理。將RT-LAMP擴(kuò)增與國標(biāo)檢測的結(jié)果進(jìn)行比對，以驗證所建立方法的準(zhǔn)確性。由圖5可知，提取活性志賀氏菌的RNA進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，檢測限能達(dá)到101CFU/mL。

圖5 活菌RNA的RT-LAMP擴(kuò)增Fig.5 RT-LAMP amplification of viable bacterial RNA

由圖6可知，提取損傷志賀氏菌的RNA進(jìn)行RT-LAMP擴(kuò)增，檢測限能達(dá)到105CFU/mL。

圖6 損傷菌RNA的RT-LAMP擴(kuò)增Fig.6 RT-LAMP amplification of damaged bacterial RNA

由表2可知，經(jīng)3次重復(fù)試驗，在活菌檢測中，從107～102CFU/mL菌液濃度RT-LAMP擴(kuò)增與國標(biāo)法均有檢出，在101CFU/mL菌液濃度時，RT-LAMP擴(kuò)增有3次檢出，而國標(biāo)法僅檢出1次。分析可能為活菌濃度太低，導(dǎo)致國標(biāo)法未能檢出而漏檢。在損傷菌模型中，國標(biāo)法在107CFU/mL有3次檢出，在106CFU/mL 菌液濃度有2次檢出，而RT-LAMP擴(kuò)增在107～106CFU/mL均有3次檢出，在105CFU/mL菌液濃度有2次檢出，分析可能經(jīng)高壓處理后，高濃度的菌液未全部殺滅，部分細(xì)菌可能受到損傷而在國標(biāo)培養(yǎng)法中不能檢出，但其RNA活性仍然存在，以RNA為檢測模板的RT-LAMP法則可檢出。綜上可知，在活菌檢測中，所建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法與國標(biāo)法趨于一致，在失活菌模型中，建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法的檢出限比國標(biāo)法高出1個數(shù)量級，所建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法準(zhǔn)確性良好。

表2 RT-LAMP擴(kuò)增與國標(biāo)法結(jié)果比較Table 2 Result comparison of RT-LAMP amplification and national standard examination

注：“G”表示國標(biāo)法，“R”表示RT-LAMP擴(kuò)增;“+”表示有檢出，“-”表示未檢出;括號中數(shù)值表示該實驗結(jié)果在3次重復(fù)試驗中的出現(xiàn)次數(shù)。

2.5 RT-LAMP的特異性和靈敏度測定

本研究共對23株細(xì)菌進(jìn)行RT-LAMP方法檢測，由表3可知，只有4株志賀氏菌產(chǎn)生熒光擴(kuò)增反應(yīng)，其他19株腸道菌均未產(chǎn)生熒光擴(kuò)增反應(yīng)，表明所建立的RT-LAMP方法具較好的特異性，可用于志賀氏菌的檢測。

表3 RT-LAMP擴(kuò)增特測定Table 3 Specificity test of RT-LAMP amplification

注：“+”表示有熒光擴(kuò)增曲線，“-”表示無熒光擴(kuò)增曲線。

由圖7可知，當(dāng)以7 fg/μL的RNA為檢測模板時，所建立方法仍能特異性擴(kuò)增檢出，比相關(guān)文獻(xiàn)報道的其他病原菌檢出效率至少高出一個數(shù)量級[13-14]。

圖7 RT-LAMP檢測志賀氏菌的靈敏度Fig.7 Detection sensitivity of RT-LAMP for Shigella

2.6 RT-LAMP和RT-PCR在人工污染脫脂乳中的檢測靈敏度對比

在陰性對照樣本中，RT-LAMP和RT-PCR均未擴(kuò)增檢出。由圖8可知,所建立的RT-LAMP擴(kuò)增在陽性樣本中的檢出限為4 CFU/mL，且全部檢測在30 min完成。

圖8 人工污染脫脂乳RT-LAMP反應(yīng)靈敏度Fig.8 Artificial contamination skim milk RT-LAMP reaction sensitivity

由圖9可知，RT-PCR的檢出限為4×102CFU/mL，表明所建立的RT-LAMP擴(kuò)增方法的檢測靈敏度比RT-PCR高出2個數(shù)量級。

M-Trans DNA Marker Ⅱ；N-陰性對照；1-4×105 CFU/mL；2-4×104 CFU/mL；3-4×103 CFU/mL；4-4×102 CFU/mL；5-4×101 CFU/mL；6-4 CFU/mL；7-0 CFU/mL圖9 人工污染脫脂乳RT-PCR反應(yīng)靈敏度Fig.9 Artificial contamination skim mlk RT-PCR reaction sensitivity

3 討論

在國際上每年都有因志賀氏菌引起的食物中毒事件發(fā)生，給人類健康和食品安全帶來極大的挑戰(zhàn)[15]。在我國細(xì)菌性痢疾感染多為志賀氏菌引起，由于地域環(huán)境多樣、衛(wèi)生條件參差不齊等原因，食品受到志賀氏菌污染而導(dǎo)致痢疾爆發(fā)較為普遍[16]。而在基層食品檢驗中，志賀氏菌的檢出率遠(yuǎn)低于其他腸道致病菌，未能引起檢測機(jī)構(gòu)和企業(yè)對其的正確認(rèn)識和重視，存在食品安全隱患。原因可能為：(1)由于自然界中存在尚未報道的志賀氏菌，或者有志賀氏菌新的變異型，基層檢測人員不能獲得其特異的生化信息，而不能有效檢出；(2)志賀氏菌的生化反應(yīng)與某些大腸桿菌相似，傳統(tǒng)國標(biāo)培養(yǎng)法依賴于檢測人員的經(jīng)驗，經(jīng)驗不足易將志賀氏菌誤判為大腸桿菌導(dǎo)致漏檢。綜上所述，僅依靠傳統(tǒng)方法對其進(jìn)行檢測和監(jiān)控，已不能滿足當(dāng)前的食品安全需求。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子檢測技術(shù)已越來越多地應(yīng)用到致病菌的檢測研究中。LAMP擴(kuò)增方法因其無需大型的專業(yè)設(shè)備，操作簡單快捷，檢測結(jié)果的靈敏性、特異性及應(yīng)用范圍遠(yuǎn)優(yōu)于其他分子檢測方法而受到人們的廣泛關(guān)注[17]。曾桂芬等[18]建立的志賀氏菌LAMP檢測方法，對純菌的靈敏度為5.3×101CFU/mL，高于傳統(tǒng)的PCR檢測。王建昌等[19]建立的志賀氏菌SPIA檢測方法，對純菌的靈敏度為1.3 CFU/mL，對模擬樣品的靈敏度為1.8 CFU/mL。本實驗所建立的志賀氏菌RT-LAMP檢測方法，對純菌RNA模板的靈敏度為7 fg/μL，對人工污染樣本的靈敏度為4 CFU/mL，遠(yuǎn)高于RT-PCR方法。且以RNA為檢測模板，有效地避免了樣本因DNA殘留而出現(xiàn)的假陽性擴(kuò)增檢出，在準(zhǔn)確性方面優(yōu)于傳統(tǒng)的LAMP檢測方法。

由于食品類別及制備工藝的不同，不同食品基質(zhì)對核酸的提取可能產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致目標(biāo)RNA的提取效率不同。本實驗僅選擇了較為穩(wěn)定的食品基質(zhì)進(jìn)行方法驗證，后續(xù)還需要擴(kuò)大志賀氏菌污染的樣本種類，以研究不同條件下對志賀氏菌RNA提取情況，RT-LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)條件及檢出限。實驗室對細(xì)菌的殺滅或損傷處理僅用了高壓方法，不能完全反映樣本中致病菌的各種情況，且經(jīng)高壓處理仍存在的志賀氏菌是否還有致病性還需要進(jìn)一步的驗證。

綜上所述，本實驗所建立的志賀氏菌RT-LAMP方法以ipaH基因為靶基因，特異性地檢出志賀氏菌，且具有快捷、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，可用于志賀氏菌的快速檢測，也為致病菌快速篩查和現(xiàn)場檢測提供新的研究方向。