黃建敏 錢哲 陳海燕 黃清 黃靈 劉國軍 唐雄林

右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣西百色533000）

癲癇遺傳學(xué)研究表明，基因突變是神經(jīng)元異常放電的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，在癲癇發(fā)病機制中起關(guān)鍵性作用［1］，同時又是耐藥性癲癇形成的重要機制。電壓門控性Na+通道（voltage-gated sodium channel，VGSC 或Nav）是神經(jīng)元膜興奮性改變的主要通道，其中SCN1A 通道是該通道的關(guān)鍵性亞型，研究發(fā)現(xiàn)，SCN1A 通道基因突變導(dǎo)致結(jié)構(gòu)或功能改變可誘發(fā)神經(jīng)元異常放電癲癇發(fā)作，甚至出現(xiàn)抗癲癇藥物有效治療量變化以及造成對某些抗癲癇藥物抵抗［2-4］。基因突變的影響因素非常復(fù)雜，如地理環(huán)境、氣候條件、種族因素等。本課題組既往對百色地區(qū)癲癇患者的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)癲癇發(fā)病率及患病率均高于全國平均水平，治療依從性極差，2∕3 在農(nóng)村地區(qū)［5］，最近對該地區(qū)癲癇患者SCN1A 基因全系列測序分析，發(fā)現(xiàn)rs4667869 和rs10497275 突變率較高［6］，推測rs4667869、rs10497275 多態(tài)性與卡馬西平療效可能存在一定關(guān)聯(lián)性。本研究擬應(yīng)用MassARRAY-IPLEX 和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption∕ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOFMS）技術(shù)對186 例卡馬西平規(guī)范治療的壯族癲癇患者SCN1A 基因rs4667869 和rs10497275 位點基因型檢測，探討該基因多態(tài)性對百色地區(qū)壯族癲癇卡馬西平療效的影響，從基因水平為壯族癲癇患者影響卡馬西平療效的病因?qū)W提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年1月至2017年8月右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診確診的186 例癲癇患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）根據(jù)臨床表現(xiàn)，結(jié)合腦電圖和影像學(xué)（頭顱MRI 或頭顱CT）檢查結(jié)果由臨床醫(yī)生確診；（2）診斷參照1981年或1989年國際抗癲癇聯(lián)盟制定標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)作類型：部分性發(fā)作及全面性發(fā)作；（3）年齡18 ～60 歲，三代均為壯族；（4）卡馬西平規(guī)范治療1年以上，初始劑量每次100 ～200 mg，每天1 ～2 次，逐漸增加劑量，最大劑量每天1 200 mg；（5）自愿參加本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）同時服用其他抗癲癇藥或其他鈉離子通道阻斷藥，如普羅帕酮；（2）嚴(yán)重器質(zhì)性病變?nèi)鐞盒阅[瘤、嚴(yán)重高血壓、不穩(wěn)定性心臟病、血液病、肝腎功能不全；（3）進行性器質(zhì)性腦病或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。療效判斷：（1）有效：固定劑量治療1年內(nèi)均沒有任何類型癲癇發(fā)作或發(fā)作頻率減少達50%以上；（2）無效：1年內(nèi)經(jīng)過最大劑量治療仍無法控制發(fā)作或發(fā)作頻率減少低于50%，需要改用其他抗癲癇藥物治療。根據(jù)療效標(biāo)準(zhǔn)，有效組66例，無效組120 例，兩組間發(fā)作類型、用藥劑量、病程、年齡等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究已通過倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 卡馬西平血藥濃度測定 利用反相高效液相色譜法檢測卡馬西平血藥濃度?？R西平達到穩(wěn)態(tài)血藥濃度后于下次服藥前空腹抽取靜脈血3 mL，3 500 r∕min 離心5 min，抽取500 μL 血清加入內(nèi)標(biāo)艾司唑侖（0.229 8 mg∕mL）15 μL 及乙酸乙脂4 mL，3 000 r∕min 震蕩離心3 min，吸取上清液，45 ℃水浴吹干，加入100 μL 甲醇溶解備用。Waters 高效液相色譜儀，色譜條件：Nova-Pak C18柱，3.9 mm ×150 mm，4 μm；流動相為甲醇：水（46：54），流速120 mL∕min，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm，取20 μL 進樣。

1.2.2 DNA 提取 抽取外周靜脈血3 mL，3 500 r∕min 離心5 min，用下層血凝塊提取DNA，試劑盒為康為世紀(jì)生物科技有限公司，保存于-80 ℃?zhèn)溆?。采用紫外分光光度儀測定DNA 純度，其A260∕A280范圍在1.6 ～2.0 之間。

1.2.3 位點選擇和引物設(shè)計 Pubmed 中檢索SCN1A基因全序列，利用Haploview軟件（version4.2）選取標(biāo)簽性rs4667869 和rs10497275 為研究靶點，通過Assay Designer（Sequenom 公司）軟件設(shè)計引物，rs4667869 特異性擴增上游引物為5′-ACGTTGGATGCTCCATAGAGAAGTTGAGTG-3′，下游引物為5′- ACGTTGGATGTGAGGTTGGGGAGGTAGAC-3′，單堿基延伸引物為5′-CGTTTTACTTAAGGGTTGTT-3′。rs10497275 特異性擴增上游引物 為 5′ - ACGTTGGATGCCTGTGTAAAGCTTGCACTC-3′，下游引物為5′- ACGTTGGATGGCTCTCAGCAAGGTTGACAC-3′，單堿基延伸引物為5′-CTGCACGTTTGAGCAAACAAATAA-3′。

1.2.4 單核苷酸多態(tài)性檢測及基因分型 應(yīng)用MassARRAY-IPLEX 和MALDI-TOF-MS 技 術(shù) 對SCN1A rs4667869 和rs10497275 基因分型。（1）PCR擴增：樣本純化后將DNA 稀釋至20 ng∕μL，建立PCR 反應(yīng)體系：取DNA 樣本1 μL、水1.850 μL、25 mmol∕L MgCl20.325 μL、PCR 緩沖液（含15 mmol∕L MgCl2）0.625 μL、25 mmol∕L dNTP 0.100 μL、PCR 引物1 μL、HotStar Taq（Qiagen）酶0.1 μL，反應(yīng)條件：94 ℃5 min，90 ℃20 s，56 ℃30 s，進行43 個循環(huán)，最后72 ℃2 min。（2）蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）反應(yīng)：添加0.3 U 的SAP 去除反應(yīng)剩余的dNTP，反應(yīng)條件為：37 ℃40 min，85 ℃5 min。（3）單堿基延伸反應(yīng)：向SAP 反應(yīng)體系加0.940 μL 延伸引物、0.619 μL 水、0.2 iPLEX 緩沖液、0.2 μL 終止混合物，反應(yīng)條件為94 ℃30 s、92 ℃10 s、56 ℃10 s、76 ℃5 s、52 ℃5 s，5 個步驟進行42 次循環(huán)，最后72 ℃2 min。（4）質(zhì)譜檢測：陽離子交換樹脂將產(chǎn)物脫鹽，384 孔SpectroCHIP bioarray 芯片（Sequenom）點樣，MALDI-TOF-MS 技術(shù)檢測多態(tài)性，MassARRAY Typer4.0 軟件進行基因分型。

1.2.3 基因型判定 計算產(chǎn)物峰值與相應(yīng)引物峰值之間的質(zhì)荷比，確定所延伸類型，判定該位點基因型（表1）。

表1 各系列對應(yīng)分子量Tab.1 The corresponding molecular weight of each succession

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析，對患者基因型分布頻率進行Hardy-Weinberg 平衡檢驗，計數(shù)資料間比較采用χ2檢驗，計量資料間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 對所有癲癇患者rs4667869 和rs10497275 位點基因型分布頻率測量值與預(yù)測值的差異性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個位點均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡（P＞0.05），說明樣本具有代表性。

2.2 基因型特征質(zhì)譜圖 rs4667869 雜合子GC 基因型在G 和C 等位基因處均出現(xiàn)強度信號峰，純合子GG、CC 基因型只有在G、C 等位基因處才出現(xiàn)強度信號峰（圖1）；rs10497275 雜合子GA 基因型在G 和A 等位基因處均出現(xiàn)強度信號峰，純合子GG、AA 基因型只有在G、A 等位基因處才出現(xiàn)強度信號峰（圖2）。

2.3 rs4667869 和rs10497275 多態(tài)性與卡馬西平療效的關(guān)系 無效組與有效組相比，rs4667869 位點等位基因分布（χ2= 11.790，P= 0.001）和基因型分布（χ2= 10.655，P= 0.005）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（表2），而rs10497275 位點等位基因分布（χ2=3.335，P= 0.068）和基因型分布（χ2= 3.046，P=0.218）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。rs4667869CC基因型與GG + GC 基因型相比，CC 基因型對卡馬西平抗癲癇療效更低，OR值（95%可信之間）為2.800（1.495 ～5.244）（表4）。

圖1 rs4667869 基因型特征質(zhì)譜圖Fig.1 The feature spectrogram of rs4667869 genotype

2.4 有效組rs4667869 和rs10497275 多態(tài)性與卡馬西平血藥濃度的關(guān)系 在卡馬西平治療有效的66 例患者中，rs4667869 位點GG+GC 基因型和CC基因型患者的血藥濃度比較（t= 1.273，P=0.083），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表5）；rs10497275 位點GG + GA 基因型和AA 基因型患者血藥濃度比較（t= 0.963，P= 0.064），差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（表5）。

圖2 rs10497275 基因型特征質(zhì)譜圖Fig.2 The feature spectrogram of rs10497275 genotype

3 討論

卡馬西平作用于神經(jīng)元Nav 的藥物作用靶點，阻斷動作電位的發(fā)散和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放發(fā)揮抗癲癇作用。SCNlA 基因編碼了神經(jīng)元Nav 1.1 的a1 亞單位，定位于染色體2q24.3 位置，在動作電位的產(chǎn)生和傳播起到至關(guān)重要的作用，SCN1A 通道是神經(jīng)元Nav 最為關(guān)鍵性亞型?；蛩窖芯匡@示，SCN1A 基因突變可改變鈉離子通道的電生理功能，導(dǎo)致鈉離子通道活性增高或降低均可引起癲癇發(fā)作，同時由于鈉通道功能的改變，造成卡馬西平作用靶點功能下降，從而影響療效，導(dǎo)致癲癇耐藥發(fā)生［7］。臨床病例研究證實，該基因是一些癲癇發(fā)病的最重要基因，并發(fā)現(xiàn)某些位點突變可導(dǎo)致卡馬西平療效下降［8］。

表2 有效組和無效組SCN1A 基因位點rs4667869 多態(tài)性分布Tab.2 The distribution of polymorphisms of SCN1A genes rs4667869 in effective group and ineffective group

表3 有效組和無效組SCN1A 基因位點rs10497275 多態(tài)性分布Tab.3 The distribution of polymorphisms of SCN1A genes rs10497275 in effective group and ineffective group

在所有已知的癲癇相關(guān)基因中，SCN1A 基因是人類癲癇最常見的突變基因，被稱為超級罪犯基因，目前數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)有1 504 種突變，但是有關(guān)SCN1A 基因多態(tài)性對抗癲癇藥物療效影響國內(nèi)研究較少。國外學(xué)者已經(jīng)在體外證實SCN1A 的外顯子突變可以影響大部分抗癲癇藥物的療效［9］?；蛲蛔兪艿竭z傳和環(huán)境因素影響，使其多態(tài)性在不同種族和不同地理環(huán)境的患者存在著明顯的差異性，導(dǎo)致一些疾病在不同種族間發(fā)病率、疾病表型和對藥物的療效存在顯著不同。百色地區(qū)是中國壯族聚集地，屬亞熱帶氣候，每年5、6月份持續(xù)38 ℃高溫，鋁土礦含量極大豐富，已經(jīng)大規(guī)模開采露天暴露20 余年，基于這些特殊的民族分布、季候條件和地理環(huán)境對基因突變有較大的影響，百色地區(qū)癲癇患者SCNIA 基因多態(tài)性與卡馬西平抗癲癇療效相關(guān)性可能更加復(fù)雜化。

表4 rs4667869 基因型與卡馬西平療效的關(guān)聯(lián)分析Tab.4 The association analysis between rs4667869 genotype and efficacy of carbamazepine

表5 rs4667869 基因型與卡馬西平療效的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 The association analysis between rs4667869 genotype and efficacy of carbamazepine ±s

表5 rs4667869 基因型與卡馬西平療效的關(guān)聯(lián)分析Tab.5 The association analysis between rs4667869 genotype and efficacy of carbamazepine ±s

基因型rs4667869 CC GG+GC rs10497275 AA GG+GA例數(shù)22 44 18 48血藥濃度（mg∕L）7.68±5.24 8.36±3.36 8.06±4.63 7.62±2.16 t 值1.273 0.963 P 值0.083 0.064

筆者關(guān)注新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含子rs4667869 和3′-非編碼區(qū)rs10497275 多態(tài)性對卡馬西平療效的影響。本研究利用MassARRAY-IPLEX 和MALDITOF-MS 技術(shù)對186 例壯族癲癇患者SCNIA 基因rs4667869 和rs10497275 多態(tài)性檢測，分析這兩個位點多態(tài)性與卡馬西平療效的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無效組與有效組相比，rs4667869 基因型分布和等位基因分布的差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，無效組CC基因型比例明顯高于有效組，而rs10497275 基因型分布和等位基因分布的差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義，與GG+GC 基因型相比，rs4667869 的變異純合子CC 基因型對卡馬西平療效更低，OR值（95%CI）為2.800。這研究結(jié)果表明SCNIArs4667869 多態(tài)性對卡馬西平治療壯族癲癇的敏感性有一定的影響，基因型為CC 的患者對卡馬西平相對不敏感，達到治療目標(biāo)比GG 或GC 型的患者需要更大的藥物劑量或更高的血藥濃度，原因可能是該位點突變影響Na+通道m(xù)RNA表達、蛋白合成和轉(zhuǎn)運，導(dǎo)致通道結(jié)構(gòu)和功能改變，使得卡馬西平作用位置和功能變化，從而導(dǎo)致卡馬西平治療無效或有效治療劑量的改變。國內(nèi)學(xué)者趙昕等［10］對卡馬西平治療兒童癲癇療效的研究，發(fā)現(xiàn)基因SCN1Ars3812718 位點多態(tài)性與卡馬西平耐藥性癲癇有關(guān)，與本研究具有類似結(jié)果。

本研究同時對有效組66 例患者rs4667869 和rs10497275 多態(tài)性與卡馬西平血藥濃度的關(guān)系進行相關(guān)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這兩個位點不同基因型患者血藥濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明SCNIA 只是卡馬西平抗癲癇作用靶點而不是代謝途徑，對卡馬西平代謝沒有影響，提示SCNIA 基因突變只有影響卡馬西平抗癲癇效應(yīng)，不會影響患者血藥濃度。

本研究證實SCNIA 多態(tài)性影響百色地區(qū)壯族癲癇卡馬西平抗癲癇效應(yīng)，可能是壯族癲癇卡馬西平耐藥性形成機制之一，但只是局限在兩個位點的獨立研究?；诎偕貐^(qū)民族分布、季候條件和地理環(huán)境等特異性，如果要得到可靠的結(jié)論，必須擴大樣本、細分民族，分析季候環(huán)境的影響，同時研究每個突變位點，以全面了解各個因素的作用方式和效應(yīng)，才有可能進一步闡明百色地區(qū)壯族癲癇卡馬西平耐藥性癲癇形成機制，有效開展臨床個體化治療。