高洋，馬方圓，禹珊珊，趙倩倩，金向群※，劉霞

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長(zhǎng)春 130020；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長(zhǎng)春 130118）

骨密度片是以大豆、淫羊藿、骨碎補(bǔ)等為配伍研制出的擬用于治療骨質(zhì)疏松的一種中成藥。大豆中的大豆異黃酮可用于防治骨質(zhì)疏松[1]，既能促進(jìn)人骨的形成又能抑制骨的吸收，對(duì)于維持髖部骨礦物質(zhì)密度以及全身的骨礦含量具有適當(dāng)作用[2]。張建東[3]使用大豆異黃酮對(duì)去勢(shì)大鼠進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大豆異黃酮對(duì)于骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度具有明顯的提高作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷對(duì)破骨細(xì)胞的生成具有抑制作用，抗骨質(zhì)疏松的作用明顯[4]。骨碎補(bǔ)是水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖，骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效[5]。實(shí)驗(yàn)室通過大量實(shí)驗(yàn)研究，將3 種藥材制成了具有抗骨質(zhì)疏松功能的骨密度片。通過藥理活性實(shí)驗(yàn)研究，該制劑具有抗骨質(zhì)疏松的功效[6]。為控制該制劑質(zhì)量，簡(jiǎn)單方便的含量測(cè)定方法亟待解決。分別測(cè)定6 種大豆異黃酮[7]和淫羊藿苷[8]含量的方法已有報(bào)道，但同時(shí)測(cè)定這7 種成分的方法仍未見報(bào)道。本試驗(yàn)建立了可同時(shí)測(cè)定增加骨密度片中7 種有效成分（大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷）含量的簡(jiǎn)單方便方法，為控制骨密度片的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

1525-2489 高效液相色譜儀（Waters公司）；AB204-N 電子分析天平（上海方瑞儀器有限公司）；5TC-C18（4.6 mm×250 mm，5m）（Agilent 公司）；US-10D 數(shù)控超聲波清洗器（中國(guó)科技儀器設(shè)備廠）。

1.2 材料與試劑

供試樣品 骨密度片由吉林大學(xué)藥學(xué)院藥劑實(shí)驗(yàn)室自制（批號(hào)：20160612）

大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：14100905）、染料木苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：14060511）、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：1604141）、淫羊藿苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：15081811）（北京世紀(jì)奧科生物生物技術(shù)有限公司）；黃豆黃苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：151224）、大豆苷元標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：151209）、黃豆黃素標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：160107）（北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司）；色譜純甲醇、乙腈（美國(guó)費(fèi)世爾公司）；磷酸為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元，黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷（經(jīng)五氧化二磷干燥）標(biāo)準(zhǔn)品適量，制備成0.3600mg/mL、0.0407mg/mL、0.3570mg/mL、0.4050mg/mL、0.080 7 mg/mL、0.075 4 mg/mL、0.200 0 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取樣品骨密度片（批號(hào)：20160612）20 片，除去薄膜衣層后粉碎，混合均勻稱，取粉末4.05g放置在燒杯中，精密加入50mL80%甲醇。放置30 min 后進(jìn)行超聲（30 min，30 ℃），放至室溫，過濾。60℃將續(xù)濾液減壓濃縮，用50mL20%乙醇溶解后，上柱〔預(yù)先處理過的D101大孔樹脂柱（1.5 cm×20 cm）〕，分別用100 mL 無(wú)水乙醇、250 mL 超純水、100 mL 無(wú)水乙醇進(jìn)行洗脫，再用100 mL20%乙醇洗脫后收集洗脫液，蒸干，將殘余物用80%甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，80%甲醇定容，混勻，0.22m 微孔濾膜濾過，濾液為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按骨密度片的處方比例分別配制不含大豆和淫羊藿的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成2 種陰性樣品溶液。

2.2.4 測(cè)定

圖1 混合對(duì)照品（A）、樣品（B）、缺大豆陰性樣品（C）、缺淫羊藿陰性樣品（D）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixture of reference substances(A),sample(B),negative sample without Soybean(C),negative sample without Epimedium(D)

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8 mL、1.0 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，用洗滌液〔A（V）∶B（V）=88∶12〕定容至10 mL，配制出不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液備用。分別精確吸取各濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10L，注入色譜儀，以X軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度、Y 軸為峰面積積分值做回歸曲線。得到大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷回歸方程，見表1。

表1 線性方程、相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear equation、correlation coefficient

結(jié)果表明，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷分別在7.200g/mL～36.000g/mL、0.814g/mL～4.070g/mL、7.140g/mL～35.700g/mL、8.040g/mL～40.200g/mL、1.620g/mL～8.100g/mL、1.500g/mL～ 7.500g/mL、0.040g/mL～0.240g/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取20161116批次樣品6 份，除去薄膜衣層，研細(xì)，精密稱定，采用“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10L 進(jìn)樣，進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷的含量均值分別為0.362mg/g、0.0382 mg/g、0.324 0 mg/g、0.308 0 mg/g、0.063 4 mg/g、0.079 6mg/g和0.8020mg/g，RSD分別0.80%、0.52%、0.46%、0.48%、0.50%、0.67%和0.33%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別稱取已知含量的樣品粉末6 份，每份1.0g，每份分別加入適量大豆苷，黃豆黃苷，染料木苷，大豆苷元，黃豆黃素，染料木素和淫羊藿苷對(duì)照品溶液,按照“2.2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測(cè)定各成分的含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷平均回收率（n=6）分別為98.54%、98.42%、98.42%、98.62%、98.42%、98.23%和98.24%；RSD 分別為0.54%、0.56%、0.89%、1.01%、0.86%、0.62%和0.56%。結(jié)果表明，各組分的平均加樣回收率均在95%～105%之間，加樣回收率良好。見表1。

表1 回收率測(cè)結(jié)果Tab 1 Recovery results

續(xù)表1

2.8 樣品含量測(cè)定

分別取批號(hào)為201611116、20161120、20161124 3批樣品，每批樣品取3 份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10L，對(duì)大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷峰面積進(jìn)行記錄，并計(jì)算各個(gè)成分的含量。見表2。

表2 樣品含量測(cè)定Tab 2 Assaying of sample （mg/g）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015 版，淫羊藿苷采用乙腈-水（30∶70）為流動(dòng)相，由于樣品種類繁多，并不能使7 種樣品達(dá)到分離效果。本試驗(yàn)還嘗試了水-磷酸：甲醇為流動(dòng)相，結(jié)果淫羊藿苷與染料木素也無(wú)法分離。為保證分離效果好，最后根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2015 版大豆異黃含量測(cè)定使用的水-磷酸（pH=3）：乙腈作為流動(dòng)相，并對(duì)流動(dòng)相比例進(jìn)行了調(diào)整。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

根據(jù)全波長(zhǎng)掃描，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷最大吸收波長(zhǎng)分別為250 nm、257 nm、260nm、249 nm、260 nm、261 nm、270nm，為保證7 種成分均有較好的吸收，選用260nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 供試品的制備

樣品中成分較多，傳統(tǒng)測(cè)定大豆異黃酮和淫羊藿苷的方法不能達(dá)到理想的分離度，為了除去部分雜質(zhì)，達(dá)到基線分離，采用D101 大孔樹脂對(duì)樣品進(jìn)行洗脫處理，并對(duì)水及20%、30%、40%乙醇洗脫情況進(jìn)行了考察，在使用20%乙醇進(jìn)行洗脫后，樣品的分離度最好，符合含量測(cè)定要求，并對(duì)含量的影響很小（加樣回收率符合要求）。故選擇20%乙醇溶液作為洗脫劑，進(jìn)行洗脫，棄去洗脫液，再用無(wú)水乙醇洗脫，收集無(wú)水乙醇洗脫液，蒸干，用80%甲醇定容，作為供試品溶液。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定骨密度片中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素和淫羊藿苷7 種有效成分含量的方法，為骨密度片的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。同時(shí)也為其他含有大豆和淫羊藿藥材的中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考依據(jù)。