朱海林，林紅強(qiáng)，譚靜，王涵，岳樂樂，李平亞，劉金平※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院天然藥物研究中心，長春 130021；2.吉林人參研究院，長春 130021）

人參（Panax ginseng C.A.Mey.）為五加科人參屬多年生宿根草本雙子葉植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥，享有“百草之王”美譽(yù)[1]。栽培的俗稱“園參”；播種在山林野生狀態(tài)下自然生長的稱“林下山參”（Mountaincultivated ginseng，MCG），習(xí)稱“籽?！盵2]。人參具有大補(bǔ)元?dú)?、安神益智的療效[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，人參具有抗氧化、抗自由基損傷、抗癌等多種藥理活性[4]。皂苷作為人參的主要功效成分，是評價其質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。按苷元結(jié)構(gòu)類型不同，可分為原人參二醇型皂苷（Ra1、Ra2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd 等）和原人參三醇型皂苷（Re、Rg1、Rg2、Rh1 等）。

有關(guān)園參對不同產(chǎn)地、不同部位的皂苷含量測定報(bào)道很多[5-7]。但有關(guān)林下山參不同部位的皂苷含量未見報(bào)道。為探討林下山參不同部位中總皂苷和單體皂苷的異同，本試驗(yàn)分別采用紫外-可見分光光度法及紫外檢測器-高效液相色譜（HPLC-UV）法對吉林產(chǎn)林下山參根、莖、葉和籽中的總皂苷及12種單體皂苷（元）進(jìn)行測定，為全面分析林下山參各部位的皂苷含量提供數(shù)據(jù)支持，也為更好地開發(fā)利用林下山參地上及地下部分提供參考。

1 材料

林下山參采于吉林省撫松市（批號：20171010）、吉林省通化市（批號：20160809）和吉林省靖宇市（批號：20161007），由吉林大學(xué)天然藥物研究中心李平亞教授鑒定為12年生林下山參。取植物全株，人工分離根、莖、葉和籽4 個部位，置陰涼處干燥。人參皂苷（元）Rb1（批號：110704-201625）、-Rb2（批號：111715-201203）、-Rb3（批號：111686-201504）、-Rd（批號：111818-201603）、-Re（批號：110754-201626）、-Rg1（批號：110703-201731）、-Rg2（批號：111779-200801）、-Rg3（批號：110804-201504）、-Rh2（批號：111748-200501）、原人參二醇（PPD）（批號：111747-201602）、原人參三醇（PPT）（批號：111755-200601）對照品（中國食品藥品檢定研究院）。人參皂苷Rc 為本實(shí)驗(yàn)室自制，采用高效液相色譜（HPLC）法檢測其純度>99%。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

1525 型高效液相色譜儀、2998 二極管陣列檢測器（Waters 公司）；721 型紫外-分光光度計(jì)（上海光學(xué)儀器有限公司）；98-1-B 型變溫電熱套（天津市泰斯特儀器廠）；R201D 恒溫水浴鍋（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；FA1104N 型萬分之一電子分析天平（上海菁華科技儀器有限公司）。

2.2 試劑及溶液配制

1%香草醛高氯酸溶液：精密稱定香草醛0.1 g，加入高氯酸溶解并定容至10 mL，即得（現(xiàn)用現(xiàn)配）。

77%硫酸溶液：取98%硫酸78 mL 緩緩注入適量蒸餾水中，冷卻至室溫，加水稀釋至100 mL，混勻備用。

3 方法與結(jié)果

3.1 紫外-可見分光光度法測定總皂苷含量[8]

3.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re 對照品適量，加甲醇制成1 mg/mL 的人參皂苷Re 溶液。

3.1.2 供試品溶液的制備[1,8]取林下山參根、莖、籽和葉制成粉末（過65 目篩），分別精密稱定250 mg，分別通過石油醚回流提取3 次，舍棄提取液；剩余殘?jiān)謩e加10 倍量水，煎煮2 次（第1 次2 h，第2 次1.5 h），煎液濾過，合并濾液，過D101 型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1 cm，柱高為10 cm），水洗脫至無色后，繼而以60%乙醇進(jìn)行洗脫至無皂苷反應(yīng)，洗脫液濃縮至干，其中，根、莖和籽樣品殘?jiān)謩e用甲醇溶解并定容至10mL，葉樣品殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?0 mL，即得。

3.1.3 測定波長的選擇及顯色反應(yīng) 吸取對照品溶液及供試品溶液適量，低溫?fù)]去甲醇，加入1%香草醛高氯酸溶液0.5 mL，置60 ℃恒溫水浴上充分混勻后加熱15 min，立即用冰水冷卻2 min，加入77%硫酸溶液5 mL，搖勻。于400～800 nm 進(jìn)行全波長掃描。

結(jié)果顯示，對照品及供試品溶液的吸收光譜圖基本相同，且最大吸收波長均為543 nm。見圖1。

圖1 人參皂苷Re 對照品及人參根總皂苷供試品溶液的吸收光譜曲線圖Fig.1 Absorption curves of ginsenoside Re and total ginsenosides

3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取人參皂苷Re 對照品溶液20μL、40μL、80μL、120μL、160μL、200μL，按“3.1.3”項(xiàng)下方法測定，于543 nm 測定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)、人參皂苷Re 的量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=3.8508X 0.0134，r=0.9991。

電力通信網(wǎng)是保證電力系統(tǒng)安全、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)運(yùn)行的專網(wǎng)。在電力通信網(wǎng)中傳送的業(yè)務(wù)有遠(yuǎn)動通道、數(shù)據(jù)采集通道、監(jiān)視控制通道、繼電保護(hù)通道等等業(yè)務(wù)。[1]其中繼電保護(hù)的信號具有允許傳輸時間短、通道發(fā)送幾率低、發(fā)送時間不確定等特點(diǎn)，因此對保護(hù)通道的傳輸性能有嚴(yán)格要求。繼電保護(hù)通道一旦出現(xiàn)異常，必須在盡可能短的時間內(nèi)修復(fù)，以保障電網(wǎng)運(yùn)行的穩(wěn)定。本文將分析電力通信中繼電保護(hù)通道的兩種方式，并為兩種方式的繼保通道深入探討故障定位的流程和技巧，為快速處理繼保通道故障奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3.1.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取林下山參根供試品溶液（批號：20171010）80L，按“3.1.3”項(xiàng)下方法連續(xù)測定6 次，記錄吸光度值，計(jì)算各吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）。得RSD 值為1.57%，表明儀器的精密度良好。

3.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取林下山參根（批號：20171010），精密稱定，按照“3.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別精密吸取80L，按“3.1.3”項(xiàng)下方法測定其吸光度，計(jì)算各部位總皂苷含量?？傇碥蘸康腞SD值為1.46%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取林下山參根（批號：20171010），精密稱定，按照“3.1.2”方法制備供試品溶液，室溫放置，精密吸取20L，按“3.1.3”項(xiàng)下方法分別在0 min、15 min、30 min、60 min 和120 min 測定吸光度得吸光度RSD值為1.17%，表明供試品溶液在室溫下120 min內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.8 加樣回收率 稱取已知含量的林下山參根（批號：20171010）約125 mg，共6 份，加入人參皂苷Re對照品約5 mg，按照“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取80L，按“3.1.3”項(xiàng)下方法測定，分別計(jì)算回收率及RSD。得回收率分別為103.8%、98.6%、97.6%、103.4%、99.1%和106.7%，RSD 值為2.87%。表明回收率良好。

3.1.9 樣品的測定 取3 個批次的林下山參各部分進(jìn)行混合（1∶1∶1），即得混合后樣品。按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取供試品混合溶液80L，按“3.1.3”項(xiàng)下方法測定吸收度，平行測定3份樣品，結(jié)果乘以0.84，計(jì)算其總皂苷含量[5]。結(jié)果可見，林下山參葉中總皂苷含量遠(yuǎn)高于其它部位中的總皂苷含量。見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果Tab.1 Determination results of samples （n=3，±s）

表1 樣品含量測定結(jié)果Tab.1 Determination results of samples （n=3，±s）

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3.2 HPLC-UV 法測定12種單體皂苷（元）含量

3.2.1 色譜條件 色譜柱：UnitaryC1（84.6 mm×250 mm，5m）；檢測波長：203 nm；流動相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）；梯度洗脫：0～35 min20%～23%A，35～55min 23%～28% A，55～80 min 28%～30% A，80～100 min 30%～35%A，100～140 min 35%～100%A；柱溫：30 ℃；流速：1.3 mL/min。

3.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取人參皂苷（元）Rg1、-Re、-Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2和-PPD對照品適量，加甲醇溶解并制成混合對照品溶液，各對照品的濃度依次為0.240 mg/mL、0.360 mg/mL、0.260 mg/mL、0.280 mg/mL、0.320 mg/mL、0.120 mg/mL、0.140 mg/mL、0.360 mg/mL、0.024 mg/mL、0.030 mg/mL、0.010 mg/mL、0.015 mg/mL。

3.2.3 供試品溶液的制備 取“3.1.2”項(xiàng)下制備的供試品溶液，即得。

表2 各人參皂苷（元）的線性回歸方程和范圍Tab.2 Linear regression equations and range for ginsenosides and aglycones

3.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取批號為20171010 林下山參根供試品溶液20L，在“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄各人參皂苷（元）的峰面積，計(jì)算各峰面積的RSD（n=6），人參皂苷（元）Rg1、-Re、Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2 和-PPD 的RSD 分別為1.21%、1.35%、1.05%、1.78%、1.14%、1.45%、1.27%、1.39%、1.07%、1.31%、1.57%和1.31%，表明整個檢測系統(tǒng)的精密度良好。

3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為20171010 的林下山參根樣品，精密稱定，按照“3.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣20L，記錄色譜圖，外標(biāo)法計(jì)算各皂苷（元）含量及其RSD值，人參皂苷（元）Rg1、-Re、Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2 和-PPD 的RSD 分別為1.27%、1.77%、1.93%、1.74%、1.66%、1.57%、1.73%、1.81%、1.34%、1.45%、1.57%%和1.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為20171010 的林下山參根樣品，精密稱定，按照“3.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，室溫放置，分別在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 時進(jìn)樣測定，人參皂苷（元）Rg1、-Re、Rg2、-Rb1、-Rc、-Rb2、-Rb3、-Rd、-Rg3、-PPT、-Rh2 和-PPD 的峰面積RSD 值分別為1.67%、1.24%、1.33%、1.04%、1.11%、1.34%、1.21%、1.74%、1.27%、1.08%、1.33%和1.40%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.8 加樣回收率 稱取已知含量的林下山參根（批號：20171010）約125mg，共6 份，加入適量各人參皂苷（元）對照品，按照“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算各回收率及RSD 值，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率結(jié)果Tab.3 Spike recovery test of monomer reference ginsenosides and aglycones （n=6）

3.2.9 含量測定結(jié)果 按“3.1.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，在“3.2.1”項(xiàng)下色譜條件下分別進(jìn)樣20L，通過外標(biāo)法計(jì)算出林下山參不同部位12 種單體皂苷（元）的含量，結(jié)果見表4。

表4 林下山參中不同部位的12 種單體皂苷（元）含量Tab.4 Contents of 12 monomer ginsenosides in differents parts of MCG% （±s，n=3）（%）

表4 林下山參中不同部位的12 種單體皂苷（元）含量Tab.4 Contents of 12 monomer ginsenosides in differents parts of MCG% （±s，n=3）（%）

注：-.表示未檢出 Note:-.means can not be detected

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圖2.林下山參根、莖、葉、籽及對照品的HPLC 色譜圖Fig.2.The HPLC chromatograms of root,stem,leaf,seed of MCG and stardands

4 結(jié)論

通過香草醛-高氯酸比色結(jié)合紫外-可見分光光度法測定了3 產(chǎn)地林下山參混合樣品不同部位中的人參總皂苷含量。結(jié)果顯示，林下山參葉中總皂苷含量最高（21.4%），其次為莖（5.1%）、根（4.4%）和籽（3.9%）。

利用HPLC-UV 法對單體皂苷（元）進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示，4 個部位中12 種單體人參皂苷（元）的含量差異較大： Rb1、-Rg1、-RC、-Re 和-Rd 根中含量較多（0.460%、0.357%、0.297%、0.206%和0.153%），占總皂苷的33.4%；Re、-Rd、-PPT 和-Rb3（0.210%、0.190%、0.174%和0.160%）莖中含量較多，占總皂苷的14.4%；人參皂苷（元）Re、-Rd、-Rg1、-Rb3、-Rc、-Rb2 和-PPT（1.558%、1.489%、0.708%、0.431%、0.339%、0.325%和0.204%）葉中含量較多，占總皂苷的23.6%；籽中Re、-Rg1 和-Rd（0.677、0.349 和0.282%）含量較多，占總皂苷的33.5%。以上各結(jié)果可為林下山參各部位的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)，同時也為莖、葉等地上部分的進(jìn)一步開發(fā)與利用提供了科學(xué)依據(jù)。