逄世峰，閆梅霞，王佳，崔麗麗，馬瑩，樸承熙，崔東河，王英平※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112；2.集安人參研究所，通化 134200）

靈芝為擔(dān)子菌綱多孔菌科（Polyproraceae）靈芝屬（Ganoderma）真菌赤芝〔Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.〕和紫芝（G.japonicum Zhao Xu et Zhang）的干燥子實(shí)體[1]。靈芝含有多種化學(xué)成分，其中三萜酸類(lèi)化合物為主要有效成分之一，具有抗腫瘤、保肝、解毒、抗衰老等多種藥理作用[2-4]。目前，靈芝中三萜酸的測(cè)定多采用高效液相色譜（HPLC）方法，但該法分析時(shí)間較長(zhǎng)，一般60 min以上，而且檢測(cè)化合物較少[5-6]。本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）測(cè)定靈芝中赤芝酸C、赤芝酸N、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、脫乙酰靈芝酸F、靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸D、赤芝酸D、靈芝酸F 含量，以期為靈芝中這11種三萜酸含量的測(cè)定提供一種準(zhǔn)確、靈敏、快速的分析方法，為靈芝質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜儀ACQUITY（Waters 公司）；赤芝酸C、赤芝酸N、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、脫乙酰靈芝酸F、靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸D、赤芝酸D、靈芝酸F（四川維克奇生物科技有限公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher 公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

靈芝栽培于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所左家試驗(yàn)基地農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)白山野生生物資源觀測(cè)站，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所許世泉副研究員鑒定為多孔菌科靈芝屬真菌赤芝（G.lucidum）的子實(shí)體。將靈芝切片，于50 ℃烘干至恒重，中藥粉碎機(jī)粉碎，待用。

2 試驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液制備

分別精密稱(chēng)取赤芝酸C、赤芝酸N、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、脫乙酰靈芝酸F、靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸D、赤芝酸D、靈芝酸F 對(duì)照品5.08 mg、4.60 mg、4.56 mg、4.17 mg、4.56 mg、3.83 mg、4.82 mg、5.55 mg、4.82 mg、5.01 mg、5.56 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度。

2.2 供試品溶液制備

取樣品粉末1.0 g，加乙醇20 mL，室溫超聲（功率500 W，頻率40 kHz）提取30 min，過(guò)濾，提取2 次，合并提取液，濃縮至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，靜置。吸取上清液，過(guò)0.22m PTFE濾膜，待進(jìn)樣分析。

2.3 色譜條件[7]

色譜柱：ACQUITYUPLC HSST3（2.1mm×50mm，1.7m）；流動(dòng)相：乙腈-0.03%磷酸水溶液（梯度洗脫：0～13 min 19%～29.4%乙腈，13～16 min 29.4%～45%乙腈）；流速：0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2L；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm。

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系

將混合對(duì)照品溶液分別用甲醇稀釋?zhuān)瞥梢幌盗袧舛鹊幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)品溶液，依次注入超高效液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性方程Table 1 Linear equation

3.2 精密度試驗(yàn)

取同一濃度的對(duì)照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣量2μL，測(cè)定峰面積。赤芝酸C、赤芝酸N、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、脫乙酰靈芝酸F、靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸D、赤芝酸D、靈芝酸F的RSD分別為0.89%、1.08%、1.95%、1.78%、1.41%、1.82%、1.69%、1.38%、0.93%、0.76%、0.68%，表明儀器精密度良好。

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一靈芝供試品溶液，室溫下放置，分別于0 h、6 h、12 h、18 h、24 h 按上述色譜條件進(jìn)樣分析。得赤芝酸C、赤芝酸N、靈芝酸G、靈芝烯酸B、靈芝酸B、脫乙酰靈芝酸F、靈芝酸A、赤芝酸A、靈芝酸D、赤芝酸D、靈芝酸F 峰面積的RSD 分別為2.57%、2.79%、3.22%、3.93%、2.58%、3.24%、1.36%、1.51%、2.53%、3.36%、1.87%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份靈芝樣品，精密稱(chēng)取6 份，按供試品溶液的制備方法處理，進(jìn)樣分析。測(cè)得赤芝酸C 平均含量為0.108mg/g、RSD3.75%，赤芝酸N 平均含量為0.097mg/g、RSD 4.97%，靈芝酸G 平均含量為0.43 mg/g、RSD 2.33%，靈芝烯酸B 平均含量為0.147 mg/g、RSD 3.94%，靈芝酸B 平均含量為0.537 mg/g、RSD 2.85%，脫乙酰靈芝酸F 平均含量為0.757 mg/g、RSD 2.02%，靈芝酸A 平均含量為3.727 mg/g、RSD 1.48%，赤芝酸A 平均含量為0.867 mg/g、RSD 1.76%，靈芝酸D 平均含量為1.963 mg/g、RSD 2.06%，赤芝酸D 平均含量為0.257mg/g、RSD2.25%，靈芝酸F平均含量為1.027mg/g、RSD 1.12%，表明重復(fù)性良好。

3.5 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的樣品粉末6 份，添加一定量的三萜酸對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率Tab.2 Recovery of sample （n=6）

3.6 樣品測(cè)定

按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法操作，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品。結(jié)果見(jiàn)表3，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品UPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and sample

表3 靈芝中11種三萜酸含量Tab.3 Content of eleven triterpenoid acids in G.lucidum

由圖1 和表3 可知，靈芝中含有多種三萜酸類(lèi)化合物，以靈芝酸A、靈芝酸D、靈芝酸F 含量最高。

4 結(jié)論

考察了BEH C18 和HSS T3 2 種型號(hào)色譜柱的分離效果，各標(biāo)準(zhǔn)品基本均達(dá)到基線分離。采用BEHC18色譜柱分離時(shí)，樣品在靈芝酸A 處色譜峰所占比例較大，說(shuō)明有其他物質(zhì)混雜；采用HSST3 色譜柱分離時(shí)，靈芝酸A 處色譜峰所占比例變小，故選擇HSS T3 色譜柱進(jìn)行測(cè)定。由紫外光譜圖可知，11 種三帖酸在248～264nm之間有最大吸收（圖2），故選擇258 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。本方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定，可在16 min內(nèi)完成11 種三萜酸的定量分析，為靈芝質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

圖2 11種三萜酸光譜圖Fig.2 Spectrogram of eleven triterpenoid acids